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淀粉是地球上重要的生物质资源，α淀粉酶可使淀粉水解，从淀粉链的内部切开α-1，4糖苷键。参与淀粉糖化是α淀粉酶最重要的用途之一，糖化过程要求α淀粉酶耐酸、不依赖钙离子，而目前市场上应用的α淀粉酶并不完全符合要求。本文从两方面着手从自然界中寻找酸性不依赖钙的α淀粉酶基因资源：一是从富集宏基因组DNA中克隆；二是从传统筛菌开始进而克隆有价值的基因。具体工作如下：
利用反向-巢式PCR(IN-PCR)从富集土壤宏基因组DNA中克隆到一种α-淀粉酶基因的全序列，其基因登录号为GU045523，测序分析显示与来自Bacillus sp.KR-8104耐酸淀粉酶不完整基因同源性为99％。将获得的α-淀粉酶成熟肽基因与表达载体pSE380连接，导入Escherichia.coli JM109中，IPTG诱导表达。粗酶液经Ni-NTA、Sephacryl S-200纯化后测定酶学性质：重组酶GXAA的最适作用pH为7.0，最适作用温度为75℃，比酶活为356U/mg，对可溶性淀粉的Km值为11.6g/L。构建突变子E27G、A450T、E27G-A450T，其酶学性质与原始酶没有显著差别。
以产酸性淀粉酶菌株Bacillus sp.CN7的基因组DNA为模板，PCR扩增到α淀粉酶成熟肽基因，将该基因插入表达质粒pSE380中，构建重组质粒pSE380-cn7a。将重组质粒导入到Escherichia coli JM109中，IPTG诱导表达。重组酶经Sephacryl S300、Ni-NTA纯化后测定其酶学性质。重组酶CN7A的最适温度为65℃，最适pH为5.5-6.0，对可溶性淀粉的Krn值为3.784g/L，最大反应速度为101.2mg/L*min，该酶的热稳定性不依赖钙离子。
利用RT-PCR从Rhizopus oryzae GX-08总RNA中克隆到糖化酶的淀粉结合域基因，将该基因片段插入α淀粉酶基因cn7a的5’端构建融合表达质粒pSE-sbdcn7a。嵌合酶SBD-CN7A在Escherichia.coli JM109表达，并经Ni-NTA、Sephacryl S300纯化。酶学性质研究表明嵌合酶在最适作用条件方面与原始酶并无明显差别；在以生玉米粉为底物时，其比酶活提高了8.7倍，而以可溶性淀粉为底物时其比酶活是原始酶的1.8倍，Km值也从3.784g/L降低为2.234g/L;嵌合酶在65℃下的半衰期从10min缩短为4min。上述结果表明淀粉结合域SBD的融合赋予了0c淀粉酶CN7A水解淀粉的能力，并可能使其构象发生了改变。