Notch信号是细胞与细胞之间直接作用的主要信号通路之一，并对多细胞生物中细胞命运的决定起关键作用。一般说来，Notch信号修饰外部环境的诱导信号，抑制细胞特定的分化途径，促进细胞自我更新或使细胞选择另外的分化途径。造血干／祖细胞与造血微环境的基质细胞表面分别表达Notch受体和配体，Notch信号对造血细胞发育的各个阶段均有调节作用。激活Notch信号通路能够促进造血干／祖细胞的自我更新，并抑制其分化，从而为体外扩增造血干／祖细胞提供了一个新的策略。另外，造血微环境中另外一种干细胞——间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）也表达Notch信号分子，但Notch对MSC增殖分化的调节机制还没有阐明。本研究观察了Notch信号对脐带血造血干／祖细胞的扩增作用以及对骨髓MSC分化的影响。 1．Notch信号激活对脐带血CD34⁺细胞体外增殖分化特性的影响 Notch胞内区（the Intracellular Domain of Notch，ICN）是Notch的活性形式，通过载体介导ICN在细胞内高表达就可以在没有配体存在的情况下激活Notch信号。RT-PCR方法检测到脐带血CD34⁺细胞表达Notch1受体，单个核细胞表达Notch1和它的配体Dll-1、Jagged1，表明在生理条件下，脐带血细胞的增殖分化可能受到Notch信号的调控。为确定Notch信号激活对脐带血CD34⁺细胞体外增殖分化特性的影响，我们从K562细胞克隆ICN，并构建逆转录病毒表达载体，转染包装细胞后获得逆转录病毒。利用免疫磁性分离的方法分离脐带血CD34⁺细胞。通过逆转录病毒介导将ICN导入人脐带血CD34⁺细胞。激活Notch信号延长了脐带血CD34⁺细胞体外无血清培养存活的时间。在2～3个月的无血清培养过程中，培养体系中始终存在少量原始的造血细胞，CD34⁺细胞含量约为1％，有形成CFU-GM和CFU-M的能力，细胞始终处于分裂增殖状态，说明激活Notch信号能够抑制造血干／祖细胞的分化，促进它们的自我更新。这为通过克隆表达配体激活Notch信号体外扩增脐带血造血干／祖细胞提供了依据。 2．Notch配体Dll-1胞外区的克隆、可溶性表达、纯化及在脐带血造血细胞体外扩增中的应用 Delta-like-1（Dll-1）是Notch配体之一，我们观察了其胞外区的可溶性形式对脐带血造血祖细胞的扩增作用。从人骨髓单个核细胞中提取总RNA，用RT-PCR的方法扩增Dll-1胞外区基因(hDll-1^ext)，克隆到T载体。测序正确后，亚克隆博」:学位论文:摘要到peDNA3.1/Mye一HIS（+）A表达载体。用脂质体转染CHO细胞，G418筛选单克隆，Western blot检测hDll一1“xt的分泌表达情况。选择表达量高的细胞克隆，扩增并收集上清。用金属亲和层析柱从上清中纯化蛋白hDll一1“双。利用免疫磁性分离方法分离脐带血CD34十细胞。在无血清培养体系中，hDll一1“’‘分别和不同细胞因子组合联合培养CD34+细胞，通过集落形成实验检测hDll一1“xt对造血干/祖细胞的扩增作用。hDll一1“xt能提高培养后细胞的CFU--Mix和HPP一CFC数量（是对照的1.5一2倍），其中hDll一1““联合SCF、IL一3、IL一6的扩增作用最强，无血清培养sd、12d后，HPP^CFC分别增加为培养前的9.7、43倍（对照组分别增加为培养前的6.5、26倍）。hDI卜le’‘对CFu一M血和HPP一CFC的扩增不是通过提高无血清培养体系中的细胞总数或CD34+细胞含量实现的。由于CFU^Mix和HPP一CFC代表较原始的造血祖细胞，说明重组hD 11一1“Xt对脐带血原始造血祖细胞具有扩增作用。研究结果表明，可溶性Dll一1胞外区联合造血生长因子可能是体外扩增造血干/祖细胞的有效策略。 3.NotCh信号促进骨髓MSC向成骨细胞分化 MSC向成骨细胞的分化受多种信号的调控。我们利用RT--PCR检测到MSC表达Notchl和Jaggedl，表明Notch信号可能调节MsC的增殖分化。分离纯化并扩增人骨髓MSC，通过逆转录病毒介导的基因转移方法转染ICN激活Notch信号。然后用地塞米松诱导MSC向成骨细胞分化。转染ICN的MSC较对照细胞在分化过程中碱性磷酸酶活力明显升高，钙的沉积增加，表明Notch信号有促进MSC向成骨细胞分化的作用。Deltexl是近年来发现的Notch下游分子之一，为探讨Deltexl是否参与了Notch信号对MSC向成骨细胞分化的调节作用，我们克隆了全长Del texlcDNA，并构建表达负显性Deltexl（Dominant一negative Deltexl）基因的逆转录病毒载体。获得逆转录病毒后转染MSC，进而观察灭活内源性Deltexl对MSC向成骨细胞分化的影响。转染负显性Deltexl能够减缓诱导剂对MSC向成骨细胞分化的诱导作用，表明Notch可能通过下游分子Deltexl促进MSC向成骨细胞分化。 研究结果表明，Notch对不同类型干细胞的调控作用不同，Notch信号有利于造血干/祖细胞的自我更新，而促进MSC向成骨细胞的分化。阐明Notch信号调节造血干/祖细胞及骨髓MSC分化的机制将为其应用提供实验基础。