【摘 要】
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目的:建立健康人外周血抗原特异性CD8+T细胞的体外培养方法,检测CD8+T细胞中含有TRAB结构域的蛋白2A（Trab domain containing protein 2A,TRABD2A）的表达情况,探讨TRABD2A在CD8+T细胞及其外泌体介导的肿瘤免疫治疗中的潜在作用及机制,为靶向CD8+T细胞的肿瘤免疫治疗提供新的策略。方法:（1）从HLA-A2.1+健康供者的新鲜全血中根据密度差
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目的:建立健康人外周血抗原特异性CD8+T细胞的体外培养方法,检测CD8+T细胞中含有TRAB结构域的蛋白2A（Trab domain containing protein 2A,TRABD2A）的表达情况,探讨TRABD2A在CD8+T细胞及其外泌体介导的肿瘤免疫治疗中的潜在作用及机制,为靶向CD8+T细胞的肿瘤免疫治疗提供新的策略。方法:（1）从HLA-A2.1+健康供者的新鲜全血中根据密度差异离心提取出外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,将单核细胞诱导为抗原负载的成熟树突状细胞,刺激初始CD8+T细胞活化成为杀伤性CD8+T细胞,借助流式细胞术、ELISA等对细胞功能进行验证。（2）验证CD8+T中细胞TRABD2A蛋白的表达和定位。通过q RT-PCR、Western blot检测CD8+T细胞中TRABD2A蛋白和m RNA的表达情况。采用激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析TRABD2A蛋白在CD8+T细胞中的定位。（3）评估阻断TRABD2A后CD8+T细胞及其外泌体的抗肿瘤效果。使用非特异性辅因子和特异性TRABD2A单克隆抗体干预CD8+T细胞后,从细胞层面评价CD8+T细胞对靶细胞杀伤能力的变化。基于本课题组前期系统性建立的外泌体富集与纯化方法,提取TRABD2A抗体阻断前后CD8+T细胞衍生的外泌体。通过分析外泌体的质与量以及对肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖功能的影响,从外泌体角度综合分析TRABD2A抗体阻断后,CD8+T细胞整体的抗肿瘤效果。（4）用si RNA敲减TRABD2A蛋白,发现特征性差异表达的潜在相关分子,结合可能引起该分子变化的信号通路,利用q RT-PCR、Western blot以及免疫荧光等方法初步探讨TRABD2A影响CD8+T细胞抗肿瘤功能的机制。结果:成功建立自体抗原负载树突状细胞诱导的杀伤性CD8+T细胞培养方法,验证了CD8+T细胞膜上高表达TRABD2A蛋白。用非特异性TRABD2A活性调节剂或特异性抗TRABD2A单克隆抗体阻断CD8+T细胞的TRABD2A后,均能提升CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的能力,且CD8+T细胞外泌体的分泌量显著增加。阻断TRABD2A后产生的外泌体在高浓度下对肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力的抑制作用优于对照组。敲低TRABD2A蛋白后,CD8+T细胞中PLC-γ和Erk1/2的磷酸化水平增高,穿孔素、TNF-α和外泌体的表达上调。结论:阻断TRABD2A的CD8+T细胞通过介导PLCγ-Erk1/2相关通路的磷酸化激活,促进CD8+T细胞外泌体和细胞毒性效应分子穿孔素、TNF-α的表达和分泌以达到提高CD8+T细胞抗肿瘤能力增强的效果。
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