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类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种难治性多系统疾病,已有研究表明,关节腔内炎性代谢物聚集导致的关节液pH值下降可导致软骨细胞过度凋亡,并最终引起关节软骨及骨质的侵蚀和破坏。细胞焦亡(pyroptosis)是近年来新发现的一种炎症性程序性细胞死亡方式,研究发现细胞焦亡与一些自身免疫性疾病,例如RA的发生有关,提示细胞焦亡可能参与了RA的发生发展过程,但是RA发生过程中是否存在关节软骨细胞焦亡目前尚不清楚。酸敏感离子通道(acid-sesing ion channels,ASICs)是一类由细胞外质子激活的阳离子通道,主要作用是通透Na+和Ca2+。本课题组前期研究发现ASIC1a通过上调关节软骨细胞内[Ca2+]i促使RA患者关节软骨细胞凋亡,而ASIC1a在RA患者关节软骨细胞焦亡过程中的作用有待进一步研究证明。活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)是细胞内的一种重要信使分子,具有极为重要的生物学活性,在多种疾病的发生发展过程中发挥着重要的作用。已有研究表明,ROS与细胞内[Ca2+]i密切相关并参与细胞焦亡过程,但是ROS在ASIC1a介导的关节软骨细胞焦亡中的作用目前尚不清楚。本课题通过体内体外两方面实验研究佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠是否存在关节软骨细胞焦亡,同时观察ASIC1a在此过程中的作用及其可能机制。本课题主要包括以下四个方面:1.体内实验观察AA大鼠关节软骨细胞焦亡过程,以及ASIC1a在细胞焦亡过程中的作用。Sprague–Dawley大鼠40只,随机分为正常组、AA模型组、AA模型+阳性药阿司匹林(50mg/kg)组、AA模型+ASIC1a阻断剂阿米洛利(100mg/kg)组。所有大鼠于造模后第28天处死,收集大鼠血浆、脾脏、膝关节和踝关节。结果表明,弗氏完全佐剂可诱导大鼠关节软骨细胞焦亡,阻断ASIC1a可以显著抑制AA大鼠关节软骨细胞焦亡。具体表现为:阻断ASIC1a可以抑制AA大鼠踝关节滑膜增生,关节软骨侵蚀和破坏,以及多种炎症细胞的浸润,并可以抑制aa大鼠踝关节关节软骨ii型胶原(collagenii,col2a)蛋白在关节炎发生过程中的降解;阻断asic1a可以抑制aa大鼠膝关节关节软骨apoptosis-associatedspeck-likeprotein(asc),caspase-1,nod-likereceptorprotein3(nlrp3),蛋白多糖(aggrecan,agg),col2a,asic1a,il-1β,il-18的表达,阿司匹林也表现出类似的抑制关节炎炎症和关节软骨细胞焦亡的效果。以上结果提示:aa大鼠存在关节软骨细胞焦亡,阻断asic1a可以显著抑制aa大鼠关节软骨细胞焦亡。2.体外实验观察胞外酸化处理对原代大鼠关节软骨细胞焦亡的影响。原代大鼠关节软骨细胞按照如下分组:(1)ph7.4正常组、ph7.0酸化组、ph6.5酸化组和ph6.0酸化组,各组细胞分别用相应ph值的含1%fbs的培养基培养24h。(2)ph7.4正常组、ph6.0酸化6h组、酸化12h组、酸化24h组和酸化48h组,酸化处理相应时间后收集细胞和培养基上清液。(3)ph7.4正常组、ph6.0酸化组、ph6.0+caspase-1特异性抑制剂ac-yvad-cho(10μm)处理组,细胞接受相应处理后再用ph6.0的培养基处理24h。结果表明胞外酸化处理24h和48h可以促进原代大鼠关节软骨细胞asc,caspase-1,nlrp3,asic1a,il-1β,il-18的表达,同时胞外酸化处理也可以上调细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,ldh)水平以及细胞内ros水平。此外用ac-yvad-cho抑制caspase-1表达可以抑制胞外酸化处理诱导的上述蛋白和基因的表达。以上结果提示:胞外酸化处理可以显著诱导原代大鼠关节软骨细胞焦亡,并上调细胞内asic1a和ros表达量。3.体外实验观察阻断和沉默asic1a对胞外酸化处理诱导的原代大鼠关节软骨细胞焦亡的影响。原代大鼠关节软骨细胞按照如下分组:ph7.4正常组、ph6.0酸化组、ph6.0+asic1a沉默组、ph6.0+空质粒对照组以及ph6.0+asic1a特异性抑制剂pctx-1(100ng/ml)组,细胞接受相应处理后再用ph6.0的培养基处理24h。结果表明基因和蛋白上抑制asic1a可以显著抑制胞外酸化处理诱导的原代大鼠关节软骨细胞ASC,Caspase-1,NLRP3,ASIC1a,IL-1β,IL-18的表达,以及细胞培养上清液中的LDH水平。同时发现Pctx-1可以显著下调细胞内[Ca2+]i和ROS水平。以上结果提示:阻断ASIC1a抑制胞外酸化处理诱导的原代大鼠关节软骨细胞焦亡,此过程可能与其参与调节细胞内[Ca2+]i和ROS水平有关。4.体外实验观察Ca2+、ROS对ASIC1a介导的酸化诱导的原代大鼠关节软骨细胞焦亡的影响。原代大鼠关节软骨细胞按照如下分组:pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+Ca2+螯合剂BAPTA-AM(10μM)处理组、pH6.0+ROS还原剂NAC(10mmol/L)处理组,细胞接受相应处理后再用pH6.0的培养基处理24h。结果表明BAPTA-AM可以显著抑制胞外酸化诱导的原代大鼠关节软骨细胞ASC,Caspase-1,NLRP3,ASIC1a,IL-1β,IL-18的表达,以及细胞培养上清液中的LDH水平和细胞内ROS水平;ROS还原剂NAC也可以显著抑制胞外酸化处理诱导的上述蛋白和基因的表达。以上结果提示:细胞内Ca2+超载引起的细胞内ROS表达上调参与了ASIC1a介导的胞外酸化诱导的原代大鼠关节软骨细胞的焦亡过程。综上所述,本研究结果提示:AA发生过程中以及胞外酸化处理通过激活关节软骨细胞ASIC1a,调节细胞外Ca2+内流,引起关节软骨细胞内Ca2+超载,从而引起关节软骨细胞内ROS表达上调,最终诱导关节软骨细胞焦亡,加重关节软骨局部组织的侵蚀破坏和炎症反应。