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肝纤维化是指一种或多种慢性致病因子致使肝细胞弥漫性损伤，进而使肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）活化增殖并导致细胞外基质（extracellular matrix, ECM）大量沉积的一种病理过程。HSC的活化增殖是肝纤维化发生发展的中心环节，抑制HSC的活化增殖可减缓或阻止肝纤维化的发生。 研究发现在机体多种组织或器官的纤维化疾病进程中，都发现有microRNA（miRNA）的调控作用。MiRNA能调控多种促肝纤维化或抑肝纤维化相关因子，反过来，肝纤维化的发生又能使多种miRNA表达发生变化。近年也有研究发现miR-145与多种纤维化的发生发展密切相关，但是miR-145在肝纤维化以及肝星状细胞活化过程中的作用鲜有报道，这需要进一步的研究。 本实验主要观察miR-145在肝纤维化发生过程中和HSC活化过程中的表达变化，并进一步探讨miR-145对转化生长因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）诱导的HSC活化增殖的影响及其可能的作用分子机制。研究内容主要概况如下： （1）ZEB2和miR-145在肝纤维化过程中的表达 体内我们采用四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）皮下注射4周建立小鼠肝纤维化模型，取肝组织进行HE和Masson染色，同时检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和I型胶原（Collagen type1, Colα1）的蛋白表达鉴定模型构建成功。通过qPCR技术检测肝组织和原代HSC中ZEB2和miR-145的表达，同时采用免疫荧光双染技术观察ZEB2是否表达于肝星状细胞中。体外我们采用不同浓度TGF-β1分别对大鼠肝星状细胞HSC-T6和人肝星状细胞LX-2进行刺激，24h后检测ZEB2和miR-145的表达变化。结果发现在CCl4诱导的肝纤维化小鼠的肝组织和原代HSC中以及体外TGF-β1处理的HSC中，miR-145的表达均是降低的，而ZEB2表达水平升高。ZEB2和α-SMA双重染色显示，ZEB2主要表达于α-SMA阳性的细胞即HSC中。 （2）miR-145对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞活化增殖的影响 在HSC-T6中，采用miR-145 mimics和inhibitor建立过表达和沉默miR-145细胞模型，同时采用TGF-β1（10ng/ml，24h）进行刺激，Western blot检测处理后的HSC-T6细胞中Colα1和α-SMA的蛋白表达，流式细胞术检测细胞周期情况。结果显示：过表达miR-145能抑制Colα1和α-SMA的蛋白表达，同时使TGF-β1引起的HSC-T6增殖明显减少；沉默miR-145，使TGF-β1诱导的HSC-T6增殖增多，同时Colα1和α-SMA的蛋白表达水平进一步升高。 （3）ZEB2对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞活化增殖的影响 在HSC-T6细胞中，采用ZEB2小干扰RNA（ZEB2 siRNA）建立沉默ZEB2细胞模型，同时采用TGF-β1（10ng/ml，24h）进行刺激，Western blot检测处理后Colα1和α-SMA蛋白表达，流式细胞术检测细胞周期情况。结果显示：沉默ZEB2能抑制Colα1和α-SMA的蛋白表达，同时使TGF-β1诱导的HSC-T6增殖明显减少。 （4）miR-145与ZEB2之间靶向关系的研究 使用生物信息学软件分析了解到miR-145同ZEB2之间存在可能的靶向关系。在HSC-T6细胞中，我们采用miR-145 mimics和inhibitor建立过表达和沉默细胞模型，Western blot检测ZEB2 mRNA和蛋白表达情况。结果显示：过表达miR-145能抑制ZEB2 mRNA和蛋白表达，而沉默miR-145能升高ZEB2 mRNA和蛋白表达。进一步，本课题组采用双荧光素（萤火虫和海肾）酶报告基因实验确认两者的靶向关系，发现共转染miR-145 mimics和ZEB2的3’端非编码区（3’ untranslated region,3’-UTR）质粒能抑制HSC-T6细胞中ZEB23’-UTR的相对荧光值表达。 （5）miR-145和ZEB2对Wnt/β-catenin信号通路的影响 在HSC-T6中，采用miR-145 mimics、inhibitor和ZEB2 siRNA进行转染以后，采用Western blot技术检测β-catenin及其下游靶蛋白cyclinD1和c-Myc的表达情况。结果显示：过表达miR-145和沉默ZEB2能抑制β-catenin及其相关靶蛋白的表达，而沉默miR-145则能促进β-catenin及其相关靶蛋白的表达。 上述结果提示，miR-145可能通过靶向ZEB2来负调控Wnt/β-catenin信号通路进而影响HSC-T6细胞的活化增殖。