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背景氧化应激损伤是阿尔茨海默综合症及创伤性脑损伤等多种神经性疾病神经元损伤的重要原因,其作用在神经损伤发生发展过程中具有极为重要的作用。中枢神经元在损伤过程中产生大量的氧自由基,从而诱导神经元细胞凋亡或死亡,使细胞产生不可逆转的损伤。海马是颅内对氧化应激损伤最为敏感的神经区域,也是认知功能最重要的相关区域,因此,氧化应激损伤可以引起海马神经元损伤从而导致认知功能障碍。越来越多的研究表明,认知功能障碍对于病人日常生活活动能力的影响常常远远超过了其对于躯体功能障碍的影响。认知功能障碍不仅影响病人的社会适应能力,而且影响颅脑损伤的全面康复。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶在人体内尤其是颅内氧自由基的产生过程中起着极为的重要作用,NADPH 氧化酶是由 p40phox、p47phox、p67phox、p22phox 和gp91phox等5个亚基组成的膜结合蛋白,其中gp91phox定位于细胞膜上,为NADPH氧化酶的主要催化亚单位。gp91phox介导电子从NADPH氧化酶传递到氧,催化氧的单电子还原反应生成O2-,随后O2-在过氧化物歧化酶的作用下反应生成H202,后者又可转化成其他的活性氧形式。磷酸二酯酶抑制剂（phosphodiesterase inhibitors,PDEIs）在临床上主要应用于治疗呼吸道痉挛、舒张血管平滑肌、增强心肌收缩力等疾病。最近有相关报道称PDEIs具有较好的抗氧化作用。PDE2是磷酸二酯酶（phosphodiesterase,PDE）家族重要的成员之一,其在边缘结构如海马和杏仁核的分布丰富,研究推测其可能参与情绪和记忆贮存调节过程,如人类稳定的陈述性记忆及啮齿类动物空间记忆的形成,但其如何影响认知功能障碍及其相关分子机制仍不明确。目的1.慢性应激引起的认知障碍及磷酸二酯酶抑制对其认知障碍的影响。2.磷酸二酯酶2抑制剂与ROS、SOD的关系。3.磷酸二酯酶2抑制剂对氧化应激损伤后NADPH氧化酶各亚基的影响。4.磷酸二酯酶2抑制剂对NADPH/ROS/CREB-BDNF信号通路下游蛋白的影响。方法1.动物行为学监测:在悬尾实验、强迫游泳实验、大理石掩埋实验和新奇进食抑制实验中,观察不同剂量磷酸二酯酶2抑制剂对慢性应激模型小鼠认知障碍的改善作用;绘制磷酸二酯酶2抑制剂在三种行为测试中的量效关系。2.与ROS、SOD水平关系的检测:用ROS及SOD检测试剂盒检测皮质酮处理后ROS及PDE2的表达水平改变情况,并研究ROS表达水平变化与PDE2表达水平的相关关系。最后用不同浓度的磷酸二酯酶2抑制剂Bay 60-7550进行治理后SOD表达水平变化情况。由此研究观察Bay 60-7550跟氧化应激损伤的关系。3.磷酸二酯酶2抑制剂对NADPH氧化酶各个亚基的影响:通过RT-PCR技术研究皮质酮损伤后NADPH氧化酶不同亚基的表达情况。检测不同浓度下磷酸二酯酶2抑制剂Bay 60-7550对皮质酮模拟的氧化应激损伤后NADPH氧化酶各亚基的表达水平及其相关蛋白的表达影响。4.磷酸二酯酶2抑制剂对NADPH/ROS/CREB-BDNF信号通路的影响:首先检测siRNA干预后对gp91phox表达水平的影响。然后通过Western blot技术检测皮质酮损伤后,用siRNA及Bay 60-7550各个浓度处理后pCREB/CREB及BDNF表达水平。最后用皮质酮预处理后,用siRNA干扰敲低gp91phox表达后,再予以Bay 60-7550治疗后检测pCREB/CREB及BDNF表达水平改变情况。结果1.磷酸二酯酶2抑制剂对慢性应激诱导的认知障碍的影响在强迫游泳及悬尾实验中,实验小鼠予以慢性不可知应激后不动时间明显延长（P<0.01）,腹腔给予不同剂量的Bay 60-7550后都可以减少小鼠的不动时间,但是0.3 mg/kg时改善效果不明显,3 mg/kg剂量时才有明显改善。在大理石掩埋实验中大理石掩埋数目及新奇抑制进食实验中进食潜伏时间的变化在Bay 60-7550作用下得到了类似的结论。2.磷酸二酯酶2抑制剂与ROS、SOD的关系随着皮质酮的浓度增加,PDE2的浓度及ROS的表达水平也明显增高。皮质酮浓度为50μM时,PDE2及ROS的表达最为明显,与对照组相比,其差异具有明显的统计学意义（P<0.001）。此外,ROS同样跟PDE2的表达具有相关性,其关系为正线性关系（R=0.8879）。用50μM皮质酮模拟氧化应激损伤后,SOD表达明显减少（P<0.01）,用Bay 60-7550干预后,SOD的表达随着Bay 60-7550的浓度的增加而增加,Bay 60-7550在2 μM时作用最为明显,与皮质酮处理后的对照组相比,其差异具有明显的统计学意义（P<0.01）。3.磷酸二酯酶2抑制剂对氧化应激损伤后NADPH氧化酶各亚基及相关蛋白表达的影响50 μM皮质酮模拟氧化应激损伤后,然后用RT-PCR研究显示p47phox、p67phox、gp91phox 三个亚基的表达明显增高了（P<0.001）,但是 p22phox、p40phox亚基没有明显变化（P>0.05）。随着Bay 60-7550浓度的增加,p47phox、p67phox、gp91phox的表达随之减低,并且,在Bay 60-7550浓度为1μM时,p47phox、p67phox、gp91phox三个亚基均有明显改变,与皮质酮处理后的对照组相比,具有统计学意义（P<0.05）。随后的亚基蛋白水平实验显示用50 μM皮质酮模拟氧化应激损伤后,gp91phox、p47phox、p67phox的蛋白表达水平明显增高,与对照组相比,其差异具有统计学意义（P<0.05）。然后用不同浓度的磷酸二酯酶2抑制剂Bay 60-7550进行治疗后显示gp91phox蛋白水平逐渐下降,在Bay 60-7550浓度为2μM时,gp91phox蛋白水平较皮质酮损伤组,具有明显的统计学意义（P<0.01）。但是p47phox及p67phox的蛋白表达水平并没有因为Bay 60-7550的应用而出现统计学改变（P>0.05）。4.磷酸二酯酶2抑制剂对NADPH/ROS/CREB-BDNF信号通路下游蛋白的影响。gp91phox的表达水平随着siRNA浓度的升高而降低,在siRNA浓度为50 nM时,gp91phox表达水平与对照组相比,其差异具有统计学意义（P<0.05）。并且在皮质酮模拟氧化应激损伤时,CREB/pCREB及BDNF的表达水平明显降低,但是siRNA干扰后可以逆转CREB/pCREB及BDNF的表达水平,并且在50 nM时,其表达与单纯皮质酮损伤组相比,其差异具有统计学意义（P<0.05）。Bay 60-7550可以反转皮质酮引起的CREB/pCREB及BDNF的表达水平降低,并且在Bay 60-7550浓度为2 μM时,CREB/pCREB的水平差异具有统计学意义（p<0.05）,在Bay 60-7550浓度超过1 μM时,其BDNF表达水平较单纯氧化应激损伤组,具有统计学意义（P<0.05）。因此,我们随后用50 μ M皮质酮及25 nM siRNA预处理后,BDNF的表达水平明显减少,用Bay 60-7550进行治疗,结果显示随着Bay 60-7550浓度增加,CREB/pCREB及BDNF的表达水平明显增加,并且在Bay 60-7550的浓度为0.5 μM时,BDNF的表达差异具有明显的统计学意义（P<0.01）,在Bay 60-7550浓度为1 μM时与单因素处理过的细胞的CREB/pCREB的表达水平相比,其差异具有统计学（P<0.05）。结论1.磷酸二酯酶2抑制剂能抑制或阻断氧化应激后引起的认知障碍。2.磷酸二酯酶2抑制剂通过NADPH氧化酶gp91phox亚基改善氧化应激损伤。3.磷酸二酯酶2抑制剂通过NADPH/ROS/CREB-BDNF信号通路改善氧化应激损伤。