鱼类链球菌的分离,鉴定和诊断技术

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鱼类链球菌是近来年在水产养殖上出现的重要病原菌,对海水鱼类的危害仅次于弧菌。80年代初曾在日本大规模流行,主要危害养殖鰤鱼、牙鲆、真鲷、暗纹东方鲀、银鲑等。90年代后,鱼类链球菌病在美国、以色列、日本、韩国、等国发生,成为近年来给世界水产养殖业造成重大经济损失的重要疾病,全世界每年因链球菌感染引起的经济损失已超过1.5亿美元。   海豚链球菌是鱼类链球菌中的一个重要种,可危害多种养殖鱼类,同时还可可引起人类感染,是水产养殖中少数几个有人类感染风险的病原菌之一。1991年在美国确诊了第一例人类海豚链球菌感染后,至今全世界至少有30人确诊为海豚链球菌感染。随着我国水产养殖业的不断发展和人们对水产品需求量的增加,鱼类链球菌感染和人类海豚链球菌存在上升的趋势。   本论文采用加有0.04%叠氮钠的BHI、TSB、TH、SF四种液体培养基结合BHI固体培养基对人工感染黄颡鱼的9个部位进行链球菌的分离培养,确定以BHI 作为基础培养基,对链球菌的培养效果最好;脑、肾、血液为最好的分离部位。选择了噁喹酸钠、硫酸粘杆菌素及链霉素三种抗生素作为杂菌抑制剂,通过三种抑菌剂对不同浓度海豚链球菌的抑制效果确定三种抑菌剂的使用浓度分别为0.06mg/mL、0.012mg/mL和25U/mL,噁喹酸与硫酸粘杆菌素的配比为1:2,研制了链球菌选择性培养基——噁喹酸、硫酸粘杆菌素BHI培养基(BHICSOA),用该培养基对猪链球菌SS25995、海豚链球菌NUF693、拟态弧菌SsN0608、气单胞菌MrM0602及鱼体样品进行链球菌培养,结果表明,BHICSOA培养基可有效抑制杂菌,对链球菌具有较强的选择性,初步可作为链球菌的选择性培养基。   用BHICSOA培养基对市售常见水产动物黏液和鳃、内脏进行了链球菌的分离培养,共分离36株链球菌类菌株,对部分菌株进行了动物回感和对小鼠的致病性试验,结果表明MrS3和TS对宿主有一定的致病性,海水鱼分离株6#可引起小鼠脑膜炎,严重影响了小鼠的正常生长;36株菌中有20株有溶血性,其中14株为典型的β溶血。采用API 20STREP对部分分离株进行了生化鉴定,发现分离菌株主要有浅绿色链球菌、乳房链球菌、豕链球菌、无乳链球菌等,少数菌株因API系统参考菌株性状不够未能定种;用针对tuf基因的链球菌属特异性引物对36株分离链球菌菌株进行进行了PCR扩增,有30株菌为扩增阳性,表明tuf基因可作为链球菌属鉴定基因;建立了基于海豚链球菌LctO和16SrRNA基因的种特异性PCR鉴定法,该法可有效用于海豚链球菌的鉴定,30株tuf阳性菌株中未发现海豚链球菌菌株。   以海豚链球菌SO3为抗原制备了兔高效免疫血清,间接ELISA效价为1:20480,经亲和层析、硫酸铵浓缩、活化生物素标记,制备了生物素标记兔抗海豚链球菌抗体,成功建立了双夹心生物素抗体-链酶亲和素ELISA检测法(BA-ELISA法),该方法对海豚链球菌特异性强,对猪链球菌、葡萄球菌等其他水产常见细菌无非特异性反应,最低检测限度为4~16×104cfu,适用于海豚链球菌的检测;BA-ELISA还可用于对鱼体鳃和黏液混合物的直接检测,与PCR 的检测法一致性为86.1%,表明该法可作为基层单位用于海豚链球菌的快速检测。   采用链球菌选择性培养基对浙江省主要海水和淡水养殖鱼类及部分市售海捕鱼类的鳃和体表进行了初步的分离和培养,结合PCR鉴定技术,对鱼体携带海豚链球菌的基本情况进行了初步的调查。结果表明:   1)湖州、温州、舟山和三门等地的淡水和海水鱼类体表和鳃均有海豚链球菌的检出,检出率为10.6%-47.5%不等。   2)水产品市场和酒店鱼类的海豚链球菌检测率分别为30.9%和35.6%,表现较高的检出率。   3)海豚链球菌检出率比例较高的海水鱼类为石首鱼科、带鱼科、鲻科、鳎科和鮨科鱼类,淡水养殖鱼类中海豚链球菌的检出率较高的养殖品种主要为罗非鱼、乌鳢、鲈鱼、黄颡鱼和鲶鱼。   4)养殖鱼类海豚链球菌检出率高于野生鱼类,体表黏液比鳃更易检出海豚链球菌。上述结果表明常见的养殖和野生鱼类中存在较高的海豚链球菌背景,对相关工作人员的健康构成了潜在的威胁。
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