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慢性粒细胞白血病(CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性增殖性疾病,在我国其发病率占成人新诊断白血病的20%以上,年发病率为10万分之1。常见的临床表现为乏力、体重减轻、出汗、腹部异常包块形成、脾脏肿大等。目前的治疗方法主要以干扰素、骨髓移植、酪氨酸激酶抑制剂为主,但存在费用昂贵、骨髓来源受限、疗效不理想、耐药性等问题。CML发病的分子基础是9号染色体与22号染色体易位形成了一个新的bcr/abl融合基因,并编码一种新的融合蛋白BCR/ABL。该蛋白具有异常增高的酪氨酸激酶活性,影响细胞内的信号传导和粘附分子的功能,干扰细胞凋亡,促进细胞增殖,最终导致慢性粒细胞白血病的发生。因此研究BCR/ABL融合蛋白及其下游信号转导通路,对探索CML及其治疗具有重要的理论意义和临床应用价值。Notch基因发现于1916年,其突变可造成果蝇的残翅,20世纪80年代中期Artavanis Tsakonas研究组首次克隆了该基因。Notch基因编码的单链跨膜受体蛋白分子量约300 kD,由2753个氨基酸残基组成。研究发现,Notch从无脊椎动物到脊椎动物的多个物种中均表达,其家族成员的结构具有高度保守性,在细胞分化、发育中起着关键作用。Notch信号介入多种细胞的凋亡、增殖、和细胞分化多效性作用,调节多细胞动物的形态发育和形成。Notch信号的病理生理变化与肿瘤发生有关。研究表明,Notch信号途径可以影响慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞的分化及发育,故研究P210Bcr/Abl蛋白所活化的信号通路与Notch信号途径之间的联系,对于进一步研究慢性粒细胞白血病发病机制,探索慢性粒细胞白血病及其新的治疗靶点有重要意义。目的构建真核表达载体myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP,通过向慢性粒细胞白血病细胞系K562转染质粒pIRES2-EGFP、myc-RAMIC-IRES2-EGFP、myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP,进一步探讨Notch1基因对K562细胞生长、增殖的影响。方法由本科室保存质粒酶切得到RBPJ(R218H)基因片段,将RBPJ(R218H)基因插入载体PCMV-myc中,获得融合基因myc-RBPJ(R218H);将myc-RBPJ(R218H)插入真核表达载体pIRES2-EGFP,构建真核表达载体myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP;利用阳离子脂质体LipofectinamineTM2000介导,将构建质粒myc- RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP瞬时转染HEK293细胞,应用Western blot与流式细胞术检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达;采用电穿孔法将质粒pIRES2-EGFP、myc-RAMIC-IRES2-EGFP、myc-RBPJ(R218H)- IRES2-EGFP导入K562细胞,应用稳定G418筛选稳定表达细胞,Western blot检测myc-RAMIC、myc-RBPJ(R218H)和EGFP在K562细胞的表达情况;从获得的稳定转染K562细胞中提取总RNA,根据GenBank中人HES1、HES5基因的碱基序列,按照引物设计原则,针对HES1、HES5基因设计引物,经RT-PCR检测转染后K562细胞HES1、HES5表达情况,以评价Notch信号途径活化状态;应用MTT法、软琼脂集落形成实验研究Notch1基因对K562细胞生长和增殖的作用。结果1、成功构建表达载体PCMV-myc-RBPJ(R218H),DNA序列分析表明myc-RBPJ(R218H)融合基因开放性读框正确,与预期设计相同;2、成功构建真核表达载体myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP,酶切质粒DNA鉴定正确,与预期设计一致;3、瞬时转染HEK293细胞后,应用Western blot证实目的蛋白myc-RBPJ(R218H)和myc-RAMIC均能在HEK293细胞正确表达,同时伴有EGFP表达,流式细胞术检测证实转染取得了良好的效率;4、电穿孔法介导K562细胞转染质粒pIRES2-EGFP、myc-RAMIC- IRES2-EGFP、myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP,应用G418成功筛选建立了稳定表达目的基因的细胞,应用Western blot鉴定证实目的蛋白myc-RBPJ(R218H)和myc-RAMIC均在K562稳定表达;5、RT-PCR检测到转染质粒myc-RAMIC-IRES2-EGFP的K562细胞Notch下游靶基因HES1表达,证实K562细胞内表达的myc-RAMIC有效活化了Notch信号途径;6、MTT法、软琼脂集落形成实验证实,Notch1蛋白显著抑制K562细胞的生长增殖能力。结论本研究成功构建了真核表达载体myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP,并鉴定能够在HEK293细胞中正确表达;通过电穿孔法将质粒pIRES2-EGFP、myc-RAMIC- IRES2-EGFP、myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP导入K562细胞内,活化了Notch信号途径; Notch1基因对K562细胞的生长、增殖具有抑制作用。这一实验结果为进一步探究Notch信号途径与Bcr/Abl蛋白所活化的信号通路之间的联系,寻找CML新的治疗靶点,探索Notch用于CML基因治疗奠定了基础。