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桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）是世界范围内具有重要经济意义的农业害虫,主要分布在热带、亚热带地区,其寄主范围十分广泛,对多种水果和蔬菜均能造成危害,导致严重的经济损失。由于其繁殖能力强、单雌产卵量高,具有极强的环境适应性和入侵扩散能力,被多个国家和地区列为检疫性对象。目前,化学杀虫剂的使用是防治桔小实蝇的主要方法。然而由于这些化学药剂长期大量不合理使用,导致该虫抗药性问题严重,防治难度增大。因此,探索桔小实蝇防控的新途径或新靶标显得尤为迫切。本学位论文以桔小实蝇为研究对象,首先探究了miRNA生物合成通路上关键基因BdAgo-1对桔小实蝇雌虫生殖的影响,证明miRNA生物合成参与桔小实蝇生殖调控。在此基础上,通过高通量测序鉴定了桔小实蝇卵巢发育不同阶段的差异表达miRNAs;采用qRT-PCR解析了7个关键差异miRNAs及其预测靶基因的表达模式;在mi R-2c靶基因预测的基础上,综合运用双荧光素酶报告系统和miRNA类似物注射等技术和手段,初步明确miR-2c靶向BdVgR调控桔小实蝇雌成虫生殖成熟的分子机制。主要研究结果如下:1桔小实蝇BdAgo-1参与卵巢发育的功能探究基于桔小实蝇基因组和转录组数据库,通过克隆获得miRNA合成通路上关键基因BdAgo-1（GenBank登录号:XP011201158.1）ORF序列。氨基酸序列分析发现,该基因编码蛋白包含1未知功能的DUF结构域及已知功能的PAZ和PIWI结构域,并与黑腹果蝇、家蚕、赤拟谷盗和东亚飞蝗具有较高同源性。系统发育分析表明,昆虫Ago-1和Ago-2明显分为两支,桔小实蝇Ago蛋白聚在Ago-1分支,进一步确认该蛋白为桔小实蝇BdAgo-1。利用qRT-PCR解析BdAgo-1在桔小实蝇不同发育阶段和不同组织中的表达模式发现,在雌成虫7日龄后的性成熟阶段和卵巢组织中,该基因表达水平均相对较高。进一步采用RNAi成功沉默BdAgo-1发现,桔小实蝇卵巢发育相关通路基因Vg1、Vg2、Vg3、Trehalase、EIPL2和MTTP表达量均显著下调。同时,BdAgo-1干扰后,桔小实蝇卵巢发育畸形及发育迟缓,但与对照相比,产卵量无显著差异。2桔小实蝇卵巢发育过程差异表达miRNA鉴定及其靶基因预测根据桔小实蝇卵巢发育情况,选取雌虫羽化后3、6、9日龄三个不同发育时期的卵巢组织进行小RNA测序,整合构建了总small RNA转录组数据库。共获得76个已知miRNA和825个新mi RNA,通过去除低表达miRNA和miRNA异构体部分,最终筛选获得85个具潜在研究意义的新miRNA。通过Veen图分析,来自卵巢不同发育时期的已知miRNA分别有76、73和73个,新miRNA分别有54、72和75个,三个时期共同表达的已知miRNA有71个,新预测miRNA有44个。上述miRNA的鉴定和分析,有利于获取更多关于调控桔小实蝇卵巢发育过程的miRNA信息。通过两两比较,发现在雌成虫6日龄vs 3日龄、9日龄vs 6日龄卵巢中各有82和6个差异表达mi RNA,并对其进行了聚类分析。利用miRanda和Targetscan软件预测了上述差异miRNA的潜在靶基因,并对靶基因进行了GO、COG和KEGG通路的注释分析。基于生物信息学分析,筛选出7个高丰度表达的差异miRNA,包括miR-263a、miR-9、miR-11595、miR-2a、miR-2b、miR-2a-2和miR-2c。利用qRT-PCR解析7个miRNA及其预测靶基因在桔小实蝇卵巢不同发育时期的表达模式发现,miRNA与靶基因间均呈现一定的负调控模式,这与小RNA测序结果类似。3 miR-2c调控桔小实蝇卵巢发育的分子机制基于miRNA鉴定及表达模式结果,聚焦miR-2c探究其在桔小实蝇卵巢发育中的功能。利用RNAi注射miR-2c类似物后,miR-2c表达量显著上升,预测的4个靶基因表达都有一定程度下降。表型观察发现,过表达miR-2c后,卵巢发育迟缓,卵黄沉积减少。利用RNAi沉默预测靶基因BdVgR发现,卵巢发育同样受阻。进一步双荧光素酶报告系统表明,miR-2c在体外条件下与BdVgR有一定程度结合,且结合位点在其ORF内。上述结果表明miR-2c可能通过靶向BdVgR调控桔小实蝇卵巢发育过程。