在我国以及世界范围内,肺癌的发病率及死亡率均位于常见恶性肿瘤的前列。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）为肺癌最常见的组织学类型（～80%）,主要包括鳞癌和腺癌等。肺癌的进展与多个癌基因的驱动相关,因此,揭示潜在的驱动基因及其作用机制对于有效控制肺癌进展具有重要意义。为了揭示NSCLC相关的关键基因,我们利用表达谱芯片对8对NSCLC肿瘤组织及其配对正常肺组织中差异分子的表达进行了检测,发现ETV4基因在肿瘤组织中显著高表达。ETV4,与ETV1、ETV5同属于ETS转录因子家族中的PEA3亚家族,其过表达与胚胎发育、糖尿病以及多种肿瘤发生进展相关。ETV4作为DNA结合转录因子,其调控的下游靶基因的异常表达在ETV4驱动的肿瘤中发挥重要作用。目前已有报道ETV4与肺腺癌的预后以及EGFR-TKI耐药相关。但是,其在NSCLC中的临床意义以及调控的靶基因远未阐明。本研究在芯片筛选与验证基础上,发现ETV4为NSCLC中显著高表达的PEA3家族成员,结合体内、体外实验以及临床标本中的检测,探讨ETV4在NSCLC形成与进展中的作用、揭示其调控的下游关键靶基因、并初步探讨ETV4—下游靶基因在其他肿瘤中的表达及临床意义。研究主要包括三部分:1.ETV4在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究;2.ETV4参与非小细胞肺癌侵袭与转移的机制研究;3.ETV4-PXN/MMP1在四种常见肿瘤中的表达及其临床意义。通过上述研究,为靶向ETV4阳性NSCLC的侵袭转移提供理论依据,为不同病理形态的特定类型肿瘤提供共同的特征标记分子。第一部分ETV4在非小细胞肺癌中的表达及其生物学作用的研究目的:分析ETV4表达与NSCLC临床病理特征的关系,揭示其在肿瘤生长与转移中的作用。方法:采用Human mRNA表达谱芯片筛选8对NSCLC肿瘤及其配对正常肺组织中差异分子的表达,结合KEGG分析差异分子参与的信号通路;采用qRT-PCR方法验证ETV4 mRNA在22对肿瘤及其配对正常肺组织中的表达;分析GEO数据中ETV4 mRNA在NSCLC中的表达变化;利用免疫组织化学染色方法（IHC）检测ETV4蛋白在NSCLC肿瘤石蜡组织中的表达,分析其与临床病理特征的相关性。此外,通过体外实验检测敲低ETV4对NSCLC细胞增殖、迁移与侵袭中的影响;慢病毒感染并筛选稳定敲低ETV4细胞,分别通过裸鼠皮下荷瘤以及尾静脉注射观察ETV4在肿瘤生长与转移中的作用。结果:1 NSCLC中ETV4 mRNA的表达显著高于正常肺组织表达谱芯片结果表明,ETV4在肺癌组织的表达显著高于匹配的正常肺组织（FC=7.14,P=0.007）。进一步通过qRT-PCR方法在22对NSCLC肿瘤及其匹配的正常肺组织中验证了ETV4 mRNA的表达。与正常肺组织相比,90.91%（20/22）肺癌组织中ETV4 mRNA表达明显上调。此外,三个GEO芯片检测数据库中同样证实NSCLC组织中ETV4 mRNA中的表达显著高于正常肺组织（P<0.001）。2 ETV4蛋白在人NSCLC中的表达及临床病理意义分析IHC结果表明,ETV4阳性表达定位于肿瘤细胞胞核中。131例组织中ETV4的阳性表达率为50.38%（66/131）,其表达与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期呈正相关（P<0.05）。进一步分析其表达与80例肺腺癌临床病理特征的相关性发现,除外ETV4表达与TNM分期呈显著正相关外（P<0.001）,与腺癌亚型以及EGFR突变均无明显相关性。此外,Kaplan-Meier分析表明,81例患者中ETV4高表达组总体存活率明显低于ETV4低表达组（P<0.0001）。综上结果表明,ETV4高表达与NSCLC的进展及不良预后相关。3体外实验观察ETV4在NSCLC细胞中的生物学作用3.1敲低ETV4检测效率ETV4 siRNA分别转染H1703、H1299、H358T细胞后,与对照组相比,ETV4在mRNA和蛋白水平表达均显著降低（P<0.05）。3.2 ETV4对细胞增殖的影响MTT检测结果表明,si-ETV4转染后H1703、H1299细胞在48h-96h增殖活性均明显低于对照组（P<0.05）;H358T细胞在72h和96h的增殖活性显着低于对照组（P<0.05）。RTCA检测结果与MTT方法基本一致。3.3 ETV4对细胞侵袭与迁移能力的影响Transwell小室迁移与侵袭实验结果显示,H1703、H1299及H358T细胞si-ETV4转染组穿过膜的细胞数明显低于对照组（P<0.05）,提示敲低ETV4后可抑制细胞迁移以及侵袭能力。4裸鼠荷瘤实验观察ETV4在肿瘤生长与转移中的作用4.1稳定敲低A549细胞ETV4的效率及功能检测shETV4慢病毒感染后筛选获得稳定感染细胞,qRT-PCR及Western Blot检测结果证实敲低效率（P<0.05）。MTT检测结果表明,A549-shETV4细胞在72h-96h增殖活性均明显低于对照组（P<0.05）;Transwell小室结果表明A549-shETV4组穿过膜的细胞数目明显少于对照组（P<0.05）。4.2裸鼠皮下荷瘤实验观察ETV4在肺癌细胞形成中的作用与对照组相比,A549-shETV4组移植瘤的形成显著被抑制（P<0.001）。取材后观察肿瘤大小并称取重量,结果表明sh-ETV4组裸鼠肿瘤大小与重量均显著低于对照组（P<0.001）。4.3裸鼠尾静脉注射观察ETV4在肺癌转移中的作用于尾静脉注射后6周取材观察肺转移灶的形成,可见A549-shETV4组裸鼠肺部肿瘤形成数目显著低于对照组（P<0.05）。此外,全景数字扫描后分析发现,敲低ETV4后可显著降低裸鼠肺转移灶的大小及数量（P<0.05）。小结:1.结合表达谱芯片筛选及验证,发现ETV4为非小细胞肺癌中显著高表达的PEA3家族成员,其表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期呈显著正相关关系,其高表达提示患者预后不良。2.瞬时转染敲低NSCLC细胞中ETV4表达可显著抑制细胞的增殖、迁移与侵袭能力。3.裸鼠荷瘤实验证实,稳定敲低ETV4后可显著抑制移植瘤的生成,减少肺内转移灶的形成。体内、外实验以及临床标本中的检测结果表明,ETV4在NSCLC中发挥重要的癌基因作用,参与肿瘤的形成与进展过程。第二部分ETV4参与非小细胞肺癌侵袭与转移的机制研究目的:筛选并验证ETV4调控的下游靶基因,揭示其在NSCLC中的作用机制。方法:siRNA转染敲低三个NSCLC细胞中ETV4表达,通过表达谱芯片检测上述细胞中差异分子的表达（其中PXN及MMP1表达显著降低）;采用qRT-PCR及Western blot方法验证过表达或敲低ETV4对PXN、MMP1表达的影响;构建报告基因通过双荧光素酶检测分析ETV4对PXN、MMP1基因启动子区的调控作用;体外实验检测敲低PXN、MMP1对NSCLC细胞增殖与侵袭的影响;回复实验观察PXN、MMP1在ETV4参与肿瘤进展中的作用;通过IHC方法检测PXN、MMP1在NSCLC中的表达、分析与ETV4的相关性及预后意义;在上述检测基础上,进一步分析上游转录抑制因子CIC对ETV4-PXN/MMP1的调控作用。结果:1.表达谱芯片检测敲低ETV4对NSCLC细胞中基因表达的影响KEGG分析表明,伴随ETV4敲低显著下调的基因参与Wnt通路、细胞周期、DNA复制、MAPK信号通路以及细胞粘附等信号通路的调节。以P<0.05且FC>3.5作为筛选标准,与对照组相比,si-ETV4组细胞中共有24个基因显著上调,49个基因显著下调。2.PXN为ETV4调控的下游重要靶基因在49个下调基因中,粘附相关分子PXN的表达显著降低（FC=4.02,P=0.019）。过表达或敲低NSCLC细胞中ETV4表达后检测对PXN表达的影响。结果表明,H1703、H1299和H358T si-ETV4组细胞中PXN在mRNA及蛋白水平的表达均显著低于对照组细胞。相反,过表达ETV4可显著诱导H358细胞中PXN表达。双荧光素酶报告基因检测进一步证实,ETV4可以结合于PXN基因启动子区调控基因表达。3.MMP1为ETV4调控的最显著变化的MMPs分子结合前述NSCLC组织表达谱芯片检测结果,23个MMPs家族成员中,仅MMP1、MMP12、MMP13和MMP14在NSCLC组织中显著上调。qRT-PCR方法在22对NSCLC肿瘤及其匹配的正常肺组织中验证了上述4个MMPs分子的表达,结果表明仅MMP1和MMP14 mRNA在肿瘤组织中的表达显著高于正常肺组织（P<0.05）。过表达或敲低实验证实MMP1与ETV4的调节显著相关。双荧光素酶报告基因检测进一步证实ETV4可以结合MMP1基因启动子区调控其表达。综合上述结果表明,MMP1为ETV4调控的最显著变化的MMPs分子。4.体外实验观察PXN、MMP1对NSCLC增殖、迁移与侵袭能力的影响将PXN siRNA、MMP1 siRNA分别转染NSCLC细胞,观察敲低PXN、MMP1对细胞功能的影响。MTT结果表明,H1299、H1703细胞si-PXN、si-MMP1组在48h-96h增殖活性均明显低于对照组（P<0.001）。Transwell小室结果表明敲低上述基因可显著抑制H1299、H1703细胞的迁移与侵袭能力（P<0.05）。5.敲低PXN及MMP1表达可逆转ETV4在NSCLC细胞增殖与迁移中的作用将ETV4表达载体转染H358细胞,筛选获得稳定过表达ETV4的细胞克隆（H358-ETV4 Vector）。MTT及Transwell实验表明过表达ETV4可显著促进细胞的增殖与迁移过程。单独或者也联合敲低H358-ETV4 Vector细胞中PXN和/或MMP1表达可逆转ETV4在细胞增殖与迁移中的作用（P<0.05）6.ETV4-PXN/MMP1表达与NSCLC患者预后不良相关在前述用于ETV4检测的131例石蜡组织中,采用IHC方法检测了PXN及MMP1蛋白的表达。PXN及MMP1阳性表达率分别为39.69%（52/131）、58.78%（77/131）,并且两者表达与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期显著正相关（P<0.05）。此外,PXN、MMP1与ETV4表达呈正相关关系。Kaplan-Meier分析表明,ETV4-PXN/MMP1高表达组患者总体存活率明显低于其他组别。7.转录抑制因子CIC在NSCLC中的表达及临床病理意义分析IHC结果表明,CIC阳性表达定位于肿瘤细胞胞核中。131例组织中CIC的阳性表达率为58.78%（77/131）,其表达与淋巴结转移、TNM分期显著负相关（P<0.05）。CIC表达与ETV4（r=-0.583,P<0.001）、PXN（r=-0.271,P=0.002）、MMP1（r=-0.355,P<0.001）表达均呈负相关关系。8.敲低CIC表达解除其对ETV4-PXN/MMP1调控轴的抑制作用转染siRNA敲低A549细胞CIC表达后,ETV4在mRNA及蛋白水平表达显著增加,同时下游靶基因PXN、MMP1表达随之升高,结果表明CIC作为上游调控分子,其表达缺失可以解除对ETV4-PXN/MMP1的抑制作用。小结:1.作为转录因子,ETV4可调控一系列下游基因表达,参与NSCLC细胞中Wnt通路、细胞周期、DNA复制、MAPK信号通路以及细胞粘附等多种重要通路的调节。2.PXN、MMP1为ETV4直接调控的下游关键靶基因,其高表达与NSCLC肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期呈显著正相关。敲低PXN、MMP1表达可一定程度逆转ETV4对NSCLC细胞增殖与迁移的促进作用。3.作为上游转录抑制因子,CIC在NSCLC组织中的表达与ETV4、PXN、MMP1呈显著负相关。抑制NSCLC细胞中CIC表达可促进ETV4及其下游分子PXN、MMP1的表达。4.CIC阴性、ETV4-PXN/MMP1阳性患者总体生存率低,提示预后不良。第三部分ETV4-PXN/MMP1在四种常见肿瘤中的表达及其临床意义目的:探讨ETV4与其下游靶基因PXN、MMP1在常见恶性肿瘤中的表达及相关性,为不同病理形态的特定类型肿瘤提供共同的特征标记分子。方法:收集术前未经放疗或化疗的68例肝细胞肝癌、47例结直肠癌、60例浸润性乳腺癌、61例甲状腺乳头状癌患者手术切除石蜡组织标本,采用免疫组织化学染色方法检测各组织中ETV4、PXN、MMP1蛋白表达,ETV4阳性表达定位于肿瘤细胞胞核,PXN、MMP1定位于胞浆。结合患者临床病理特征分析其表达的意义,同时统计分析三者在四种肿瘤中表达的相关性。结果:1.ETV4、PXN及MMP1蛋白在肝细胞肝癌中的表达及相关分析68例肝细胞肝癌组织中,ETV4、PXN和MMP1表达阳性率分别为:38.24%、48.53%和48.53%。ETV4-PXN共阳性率为25.00%,ETV4-MMP1共阳性率为27.94%。ETV4表达与肝癌患者肿瘤大小、脉管内癌栓、TNM分期相关（P<0.05）;ETV4-MMP1共表达与患者脉管内癌栓、TNM分期有关（P<0.05）。Spearman相关分析表明,ETV4与PXN（r=0.271,P=0.026）、MMP1（r=0.367,P=0.002）表达存在显著正相关关系。2.ETV4、PXN及MMP1蛋白在结直肠腺癌中的表达及相关分析47例结直肠腺癌组织中,ETV4、PXN及MMP1表达的阳性率分别为46.81%、55.32%和70.21%。其中ETV4及PXN表达与肿瘤Dukes分期、淋巴结转移、TNM分期正相关（P<0.05）。ETV4-PXN（40.43%）共表达与患者Dukes分期、淋巴结转移、TNM分期相关（P<0.05）,ETV4-MMP1（42.55%）共表达与患者Dukes分期及淋巴结转移相关（P<0.05）。Spearman相关分析表明,ETV4与PXN（r=0.586,P<0.001）、MMP1（r=0.331,P=0.023）表达存在显著正相关关系。3.ETV4、PXN及MMP1蛋白在浸润性乳腺癌中的表达及相关分析60例浸润性乳腺癌组织中,ETV4、PXN、MMP1表达的阳性率分别55.00%、50.00%、56.67%。三者表达均与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期显著正相关（P<0.05）。此外,ETV4-PXN、ETV4-MMP1共表达阳性率分别为50.00%和48.33%,与肿瘤大小及TNM分期显著相关（P<0.05）。Spearman相关分析表明,ETV4与PXN（r=0.905,P<0.001）、MMP1（r=0.696,P<0.001）表达存在显著正相关关系。4.ETV4、PXN及MMP1蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及相关分析61例甲状腺乳头状癌组织中,ETV4、PXN、MMP1阳性率为50.82%、60.66%和63.93%。ETV4-PXN共表达阳性率为39.34%,ETV4-MMP1的阳性率为37.70%,且上述基因共表达与淋巴结转移显著相关（P<0.05）。Spearman相关分析表明,ETV4与PXN（r=0.349,P=0.006）表达存在正相关关系。小结:1.肝细胞肝癌中ETV4表达与PXN、MMP1表达呈正相关关系,其中ETV4-MMP1共表达与患者脉管内癌栓、TNM分期相关。2.结直肠癌中ETV4表达与PXN、MMP1表达呈正相关,其中ETV4-PXN、ETV4-MMP1共表达均与患者Duke分期及淋巴结转移相关。3.浸润性乳腺癌中ETV4与PXN、MMP1表达高度正相关,其中ETV4-PXN共表达与肿瘤大小、TNM分期及HER2阳性相关,ETV4-MMP1共表达与肿瘤大小、淋巴结转移以及TNM分期相关。4.甲状腺乳头状癌中ETV4与PXN表达呈正相关,ETV4-PXN共表达与患者淋巴结转移相关。结论:1.结合表达谱芯片筛选及验证发现,ETV4为非小细胞肺癌中显著高表达的PEA3家族成员,其表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期以及预后不良显著正相关。敲低ETV4可显著抑制肿瘤的生成与转移过程。综合体内体外实验以及临床标本中的检测结果表明,ETV4参与NSCLC形成与进展过程,具有重要癌基因作用。2.作为转录因子,ETV4可调控一系列下游基因表达,参与NSCLC细胞Wnt通路、细胞周期、DNA复制、MAPK信号通路以及细胞粘附等多种重要通路的调节。3.PXN、MMP1为ETV4直接调控的下游关键靶基因,其高表达与NSCLC肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及不良预后显著正相关。敲低PXN、MMP1表达可一定程度逆转ETV4对NSCLC细胞增殖与迁移的促进作用。提示ETV4-PXN/MMP1调控轴可作为NSCLC进展及预后不良的分子标记。4.NSCLC组织中转录抑制因子CIC蛋白表达与ETV4、PXN、MMP1呈显著负相关关系。CIC作为上游调控分子,其表达缺失可以解除对ETV4-PXN/MMP1的抑制作用。CIC阴性、ETV4-PXN/MMP1阳性患者总体生存率低,提示预后不良。5.ETV4-PXN/MMP1共表达可见于包括非小细胞肺癌、肝细胞肝癌、浸润性乳腺癌、结直肠癌、甲状腺乳头状癌五种类型肿瘤中,基于ETV4-PXN/MMP1检测有望作为“跨瘤种”分子标志物。