卵巢癌（Ovarian cancer,OC）是世界范围内常见的妇科恶性肿瘤,大约90%的卵巢癌是通过上皮细胞转化而来的,因此这类肿瘤称之为上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancers,EOC）。由于早期缺乏有效的筛查方法,超过70%的EOC患者初步就诊时已处于晚期病变阶段,而晚期治疗方案有限,并且易出现化疗耐药,因此EOC预后较差。尽管有效的治疗策略在发展,然而美国最新的一项调查研究显示,仍有超过2/3的患者在初始治疗后复发。卵巢癌一旦发生转移,手术将不可能切除所有病变,化疗是唯一的治疗策略。因此,如何对卵巢癌进行早期诊断,以及如何提高术后化疗效果一直是卵巢癌临床研究中的热点与难点。深入研究卵巢癌的发病机制,对于EOC患者的诊断和治疗有着重大意义。乳脂肪球表皮生长因子8（Milk fat globule-EGF factor 8,MFG-E8）,又称之为乳凝集素,是一种分泌型糖蛋白,广泛分布于哺乳动物体内,研究发现MFG-E8在伤口愈合、动脉重塑和血管生成中起重要作用。近年来,越来越多的研究集中在MFG-E8在肿瘤中的作用。研究表明,MFG-E8在多种肿瘤中表达增高,如甲状腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌和淋巴瘤,MFG-E8过表达可通过多种途径促进肿瘤进展。研究发现MFG-E8可通过Hedgehog和STAT3信号传导通路诱导肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells,CSC）化疗耐药,协助维持其干细胞特性。目前有关MFG-E8在EOC中的作用、相关机制及其与肿瘤干细胞标志物在EOC中表达的相关性等问题尚无深入研究。本课题中我们针对上述问题展开,主要包括以下两方面内容:1)上皮性卵巢癌中MFG-E8和CD133的表达及其与临床特征相关性研究;2)探讨沉默MFG-E8基因对卵巢癌细胞生物学特性的影响及相关机制的研究。研究结果可为上皮性卵巢癌的发病机制及治疗提供了新的思路和策略。第一部分上皮性卵巢癌中MFG-E8和CD133的表达及与临床特征相关性研究目的:以MFG-E8及CD133为研究对象,揭示MFG-E8与肿瘤干细胞标志物CD133在上皮性卵巢癌中的表达水平,分析二者表达的相关性,研究MFG-E8和CD133表达及其与临床病理特点及预后的关系。方法:收集临床病理资料完整的88例上皮性卵巢癌患者石蜡标本作为研究对象,同时选取38例良性上皮性卵巢肿瘤作为对照组。通过免疫组织化学法检测MFG-E8在EOC及良性卵巢肿瘤的表达,以及CD133蛋白在EOC中的表达,回顾性分析MFG-E8、CD133与EOC患者的临床病理资料的关系以及MFG-E8和CD133表达水平的相关性。所有数据应用SPSS 22.0统计软件进行分析,P<0.05为有显著差异结果:1.EOC标本的临床病理资料特点本实验共纳入88例临床病理资料完善的上皮性卵巢癌患者蜡块组织标本,其中绝经前患者共40例（45.5%）,绝经后为48例（54.5%）。根据组织学分类,其中浆液性卵巢癌为最常见组织类型,共64例（72.7%）,其次为子宫内膜样卵巢癌14例（15.9%）,粘液性卵巢癌最少见,共10例（11.4%）。44例（50%）患者合并淋巴结转移,病理分级为G3共58位（65.9%）,在88例患者中,64例（72.7%）对铂类敏感,24例（27.3%）对铂类化疗原发耐药。2.MFG-E8在良性肿瘤、EOC组织中的表达情况及CD133蛋白在EOC组织中的表达情况MFG-E8蛋白阳性表达主要定位于细胞的胞浆内和或胞膜上,在38例良性肿瘤中,34例MFG-E8低表达（89.5%;SI≤6）,在88例EOC患者中,64例高表达MFG-E8（72.7%;SI>6）,24例低表达（27.3%;SI≤6）,EOC卵巢组织MFG-E8蛋白表达与卵巢良性肿瘤中MFG-E8表达相比,其差异有统计学意义（P<0.05）。CD133蛋白定位于肿瘤细胞的细胞质和质膜中。CD133+患者共54例（61.4%）,CD133-34例（38.6%）。其中同时存在MFG-E8高表达和CD133+的患者共50例（56.9%）,MFG-E8低表达合并CD133-占20例（22.7%）。3.MFG-E8蛋白的表达与EOC患者临床病理参数的相关性在88例上皮性卵巢癌患者中,MFG-E8表达与年龄、患者绝经状态、淋巴转移情况及组织病理学类型无关;FIGO III和IV患者中MFG-E8的表达明显高于FIGO I和II患者（P<0.001）;MFG-E8表达水平与腹水状态显著相关（P<0.001）;同时MFG-E8高表达与病理分级及铂类敏感密切相关（P<0.001,P<0.05）。4.CD133表达与EOC患者临床病理参数的相关性CD133表达与年龄、患者绝经状态、淋巴转移情况及组织病理学类型无关;与FIGO分期、腹水状态、病理分级及铂类敏感显著相关,有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。5.EOC中MFG-E8与CD133表达的相关性Spearman相关性分析显示,EOC组织中MFG-E8的高表达与CD133阳性表达呈正相关,结果有统计学意义（R=0.353,P<0.001）。6.MFG-E8、CD133白的表达与EOC患者生存结果的分析对该88例上皮性卵巢癌术后进行随访,随访时间10个月至84个月。Kaplan-Meier分析显示MFG-E8高表达或CD133+与EOC患者的总体存活率显著负相关,与MFG-E8低表达或CD133-的患者相比,MFG-E8高表达或肿瘤中CD133+的患者总体存活时间较短,其结果有统计学意义（P<0.01,P<0.001）。小结:MFG-E8在上皮性卵巢癌中高表达,MFG-E8与CD133在EOC中的表达水平与FIGO分期,肿瘤分级,腹水状态和对化学敏感性相关;MFG-E8在上皮性卵巢癌中的表达与CD133的表达显著正相关;MFG-E8的高表达或CD133阳性表达同卵巢癌预后密切相关。因此MFG-E8可能为上皮性卵巢癌潜在肿瘤标志物,MFG-E8及CD133对上皮性卵巢癌患者预后有重要意义。第二部分沉默MFG-E8基因对卵巢癌细胞生物学特性的影响及其机制的探讨目的:从肿瘤细胞的增殖、细胞周期分布、粘附、侵袭、迁移及对顺铂药物反应等方面观察MFG-E8对上皮性卵巢癌细胞生长特性的影响,并对其调控机制进行研究。方法:通过Western blotting检测上皮性卵巢癌不同细胞株SKOV3及A2780中MFG-E8蛋白的表达,筛选MFG-E8表达高的细胞株转染MFG-E8siRNA,采用qRT-PCR及Western blotting对转染效率进行测定,通过体外实验观察沉默MFG-E8对上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖、细胞周期分布、粘附、侵袭、迁移及对顺铂毒性等方面的影响,检测基因沉默后CDK4、Cyclin D1以及Caspase-3等蛋白的表达及多重耐药蛋白ABCB1及ABCC1mRNA水平的表达变化,并通过qRT-PCR及Western blotting分别在mRNA及蛋白水平检测沉默MFG-E8对ETM相关蛋白、MMP1、MMP2、MMP9及AKT/m TOR/p70 S6K信号通路表达的影响。每组实验重复三次。所有数据应用Graph Pad Prism5.0统计软件处理,P<0.05为有显著差异。结果:1.MFG-E8在两种卵巢癌细胞株中的表达、MFG-E8基因沉默靶点筛选及转染效率测定SKOV3细胞中的MFG-E8蛋白表达量明显高于A2780细胞,应用SKOV3做相关后续试验。qRT-PCR结果显示,SKOV3细胞转染MFG-E8 siRNA后,三条干扰转染序列均有效抑制MFG-E8 mRNA的表达,与阴性对照组相比mRNA分别下降约74.98%,46.22%,88.31%。Western blotting检测结果显示,MFG-E8蛋白的表达在MFG-E8 siRNA#3中明显低于其他两组细胞（P<0.01）。表明MFG-E8 siRNA#3序列可以有效干扰MFG-E8在mRNA及蛋白水平的表达,应用MFG-E8 siRNA#3完成后续试验。2.MFG-E8 siRNA转染对细胞增殖能力、细胞周期分布的影响及相关分子机制。1)CCK8检测结果显示:MFG-E8 siRNA转染24小时后,MFG-E8siRNA转染组及阴性对照组的增殖活性无统计学意义,转染后48、72、96和120小时后,MFG-E8 siRNA转染组细胞的增殖活性明显低于对照组,结果有统计学差异（P<0.05,P<0.01）。2)平板克隆实验结果显示:MFG-E8 siRNA转染组SKOV3细胞克隆形成的数目较阴性对照组明显减少,结果比较差异有统计学意义（P<0.05）。3)FCM检测结果表明,与对照组相比,MFG-E8 siRNA转染组G0/G1期细胞比例增加（P<0.01）,同时相应的S期和G2/M细胞比例降低（P<0.01,P<0.05）,结果具有显著性差异。4)Western blotting结果显示,MFG-E8 siRNA转染组CDK4、Cyclin D1及Caspase-3蛋白的相对表达量均较阴性对照组降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结果表明,在SKOV3细胞中沉默MFG-E8基因后CDK4、Cyclin D1及Caspase3表达均下调。Cyclin D1/CDK4复合物表达在细胞周期G1/S转化过程中起重要作用,以上结果提示沉默MFG-E8基因可通过抑制周期蛋白表达调控细胞周期停滞于G0/G1期,从而抑制肿瘤细胞增殖。3..MFG-E8 siRNA对SKOV3细胞粘附、侵袭及迁移能力的影响及分子机制1)SKOV3细胞转染MFG-E8 siRNA后,MFG-E8 siRNA转染组对Matrigel及FN的粘附率均明显降低,结果分析差异有统计学意义（P<0.05,P<0.001）。表明沉默MFG-E8基因后,可抑制SKOV3细胞对人工基底膜的粘附能力。2)Transwell小室实验结果表明:无论是在侵袭实验中还是迁移实验中,MFG-E8 siRNA转染组穿过小室的细胞数均较阴性对照组明显减少,差异有统计学意义（P<0.01）划痕实验结果:SKOV3细胞转染MFG-E8 siRNA 24、48小时,MFG-E8siRNA转染组划痕两侧的愈合速度明显弱于阴性对照组,同时对划痕面积愈合率进行定量分析,24、48小时MFG-E8 siRNA转染组划痕面积愈合率均明显小于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。3)MFG-E8 siRNA对SKOV3细胞中EMT进程的影响qRT-PCR结果显示,沉默MFG-E8基因可下调N-Cadherin、Vimentin、Snail mRNA的表达,上调E-Cadherin mRNA表达,结果有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。Western blotting结果显示,阴性对照组与MFG-E8 siRNA转染组N-Cadherin蛋白的相对表达量为（0.67±0.030）和（0.47±0.013）,差异有统计学意义（P<0.01）;两组snail+slug蛋白的相对表达量分别为（0.33±0.020）和（0.12±0.017）,差异有统计学意义（P<0.01）;阴性对照组与MFG-E8 siRNA转染组中E-Cadherin蛋白的相对表达量分别为（0.27±0.033）和（0.61±0.034）,差异有统计学意义（P<0.01）,以及两组中Vimentin蛋白的相对表达量分别为（0.53±0.081）和（0.27±0.062）,差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明,沉默MFG-E8可抑制SKOV3细胞中N-Cadherin、Vimentin、snail+sluag蛋白的表达,上调E-Cadherin蛋白表达。以上结果说明沉默MFG-E8基因可抑制EMT过程。4)MFG-E8 siRNA对细胞中基质金属蛋白酶（MMPs）表达的影响qRT-PCR及Western blotting结果表明,MFG-E8 siRNA转染组细胞中MMP1、MMP2及MMP9在mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。结果表明,沉默MFG-E8可抑制SKOV3细胞中MMP1、MMP2及MMP9的表达。以上实验结果提示沉默MFG-E8基因可以通过抑制EMT进程、降低MMPs的表达,进而抑制SKOV3细胞的粘附、侵袭及迁移能力。4.MFG-E8 siRNA转染对SKOV3细胞顺铂毒性影响及分子机制1)CCK8检测结果显示,随着顺铂药物浓度的增高,两组细胞的增殖抑制率上升,以MFG-E8 siRNA转染组细胞增殖抑制率上升明显（P<0.01）。应用Graph Pad Prism 5.0统计软件计算两组细胞顺铂的IC50,MFG-E8siRNA转染组的IC50明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。SKOV3细胞给予MFG-E8 siRNA联合顺铂处理后24小时,两组细胞增殖活性无明显差异,处理后48、72小时,可见MFG-E8 siRNA组细胞增殖活性显著低于对照组（P<0.05）。2)qRT-PCR检测MFG-E8 siRNA对相关多重耐药蛋白ABCB1、ABCC1mRNA水平表达的影响qRT-PCR结果显示,与阴性对照组相比,MFG-E8 siRNA转染组中ABCB1及ABCC1 mRNA表达均明显降低,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.001）。表明沉默MFG-E8可通过降低ABCB1及ABCC1的表达进而增加顺铂的敏感性。5.MFG-E8 siRNA对SKOV3细胞中AKT/m TOR/p70 S6k信号通路的影响Western blotting结果表明,阴性对照组与MFG-E8 siRNA转染组AKT蛋白的相对表达量为（0.77±0.031）和（0.76±0.027）,差异无统计学意义（P>0.05）;两组p-AKT蛋白的相对表达量分别为（0.73±0.028）和（0.25±0.027）,差异有统计学意义（P<0.01）,两组p-m TOR蛋白的相对表达量分别是（0.75±0.044）和（0.31±0.033）,差异有统计学意义（P<0.01）,阴性对照组与MFG-E8 siRNA转染组p70 S6K蛋白的相对表达量分别为（1.04±0.105）和（1.25±0.359）,差异无统计学意义（P>0.05）以及两组中p-p70 S6K蛋白的相对表达量分别为（0.57±0.036）和（0.13±0.017）,差异有统计学意义（P<0.01）。结果表明,沉默MFG-E8可抑制AKT,m TOR以及p70 S6磷酸化,进而抑制AKT/m TOR/p70 S6K信号通路的活性。小结:1.MFG-E8参与调控SKOV3细胞的增殖过程,沉默MFG-E8基因可抑制肿瘤细胞的增殖,使细胞周期停滞于G0/G1期,与其调控G0/G1期相关调节蛋白有关,沉默MFG-E8基因能降低Cyclin D1及CDK4的表达。同时沉默MFG-E8基因的表达可降低Caspase3的表达,支持凋亡可诱导肿瘤细胞增殖的观点。2.MFG-E8基因参与调控SKOV3细胞粘附、迁移及侵袭过程,沉默MFG-E8基因可降低SKOV3细胞与细胞外基质的粘附能力,并对肿瘤细胞的迁移、侵袭能力有抑制作用。其分子机制与沉默MFG-E8抑制EMT进程及降低MMPs表达有关。3.沉默MFG-E8基因可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,并下调多重耐药蛋白ABCB1及ABCC1 mRNA水平的表达,说明MFG-E8与化疗耐药相关。4.沉默MFG-E8基因的表达可抑制AKT、m TOR及p70 S6K磷酸化水平,从而使细胞迁移、侵袭能力下降及提高顺铂敏感性。结论:1.MFG-E8在上皮性卵巢癌中表达增高,MFG-E8和CD133的表达水平与FIGO分期,肿瘤分级,腹水状态和对铂类敏感性相关,两者可作为卵巢癌预后指标;MFG-E8可能为上皮性卵巢癌潜在细胞肿瘤标志物。2.MFG-E8参与调控EOC细胞的增殖,沉默MFG-E8可以使细胞停滞于G0/G1期,并下调CDK4、Cyclin D1、Caspase3蛋白的表达。3.沉默MFG-E8基因可以增加细胞对顺铂的敏感性,下调多重耐药蛋白ABCB1及ABCC1 mRNA的表达,针对MFG-E8的抑制剂有可能成为EOC治疗的新靶点。4.沉默MFG-E8基因可能通过抑制AKT/m TOR/p70 S6K信号通路,下调MMP1、MMP2、MMP9的表达,抑制EMT进程,进而抑制肿瘤细胞的粘附、侵袭、迁移能力及铂类耐药性。MFG-E8在上皮性卵巢癌中表达增高,MFG-E8可作为上皮性卵巢癌潜在肿瘤标志物。同时我们利用RNA干扰技术,沉默MFG-E8基因,在一系列体外研究中证实了MFG-E8参与了肿瘤细胞的增殖、粘附、侵袭、转移过程及铂类耐药性,从而为MFG-E8表达阳性的恶性肿瘤的治疗提供了新的思路和策略。