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近年来,肿瘤免疫治疗表现出了巨大的潜力,如备受瞩目的程序性死亡受体1（Programed death 1,PD-1）抑制剂已在多种肿瘤疾病的治疗过程中取得了很好的临床效果;细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（Cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4）抑制剂作为第一种也是最常用的抗PD-1联合治疗药物,与单药治疗相比,CTLA-4和PD-1双重阻断显示出更好的治疗效果,已有研究表明,二者联合用药可显著延长黑色素瘤患者的生存期。但在临床应用中,仍发现有部分患者对PD-1阻断治疗并不敏感,而CTLA-4在T细胞上广泛表达,导致CTLA-4阻断剂可能会引起较强毒副作用。T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域（T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif（ITIM）domain,TIGIT）作为另一种重要的抑制型免疫检查点分子,逐渐受到人们的关注。TIGIT是Ig超家族的一种受体,其表达主要在耗竭的T淋巴细胞及NK细胞中,故与CTLA-4相比,TIGIT阻断在肿瘤免疫治疗中具有更高的安全性。TIGIT作为免疫检查点分子,可以通过多种机制抑制T细胞活化,如TIGIT可以更高的亲和力与CD226竞争结合脊髓灰质炎受体（PVR）,进而抑制淋巴细胞活化,同时TIGIT与PVR结合可直接下调TCR,并激活免疫抑制分子FGL2的表达等。因此,研制针对人TIGIT的中和性抗体及建立可用于检测TIGIT单克隆抗体中和活性的方法,对于肿瘤免疫治疗药物的开发具有重要意义。本课题旨在制备针对TIGIT的中和性抗体并构建TIGIT中和性抗体筛选系统,传统的中和性单克隆抗体制备是使用全长蛋白作为免疫原免疫动物,经过大量筛选和鉴定工作获得抗体,但此抗体所针对的表位并不确定,还需进行复杂的表位鉴定工作,难度大且效率低。为了解决以上问题,本课题以TIGIT为例,设计了一套更优化的中和性抗体制备及筛选方案。首先,应用生物信息学软件对TIGIT全长蛋白三维结构进行分析,筛选位于TIGIT与其受体PVR结合关键位置的表位,同时使用乙肝病毒核心蛋白（HBc）及人5型腺病毒（Ad5）两种免疫载体来呈递表位肽,获得更好的免疫效果。免疫原制备完成后,通过多种免疫方式免疫BALB/c小鼠,后使用筛选抗原对所获抗体进行鉴定,获得针对TIGIT的单克隆抗体,通过特异性检测、效价检测等实验对抗体进行鉴定。为了检测所获抗体的中和活性,本课题建立了基于CAR-T细胞活化原理的TIGIT中和性抗体筛选系统,最终筛选出具有中和活性的单克隆抗体。本课题的具体研究内容主要分为以下几个方面:1.TIGIT B-cell表位的筛选应用生物信息学网站对TIGIT全长蛋白进行分析,通过比较多项参数,同时参考TIGIT与PVR结合的晶体衍射结果,最终确定了两个潜在的具有中和活性的抗原表位 Epitope1（EP1）:VNWEQQDQLLAICNADL（V57-L73）和Epitope2（EP2）:HTYPDGTYTGRIFLEVL（H111-L127）,并合成编码两个表位肽的碱基序列,用于后续抗原制备工作。2.免疫原的表达及纯化本课题使用HBc及Ad5重组腺病毒作为免疫载体呈递表位肽,以HBc-TIGITEP1-2（EP1-2代表EP1或者EP2）融合蛋白及TIGITEP1-2修饰的重组腺病毒作为免疫原,用于制备针对TIGIT的单克隆抗体:（1）HBc-TIGIT EP1-2融合蛋白的表达及纯化通过分子克隆技术将筛选出的两个表位肽插入HBc的免疫显性区（MIR）,分别构建pET-28a/HBc-TIGITEP1-2原核表达载体,并分别转化至E.coli Rosetta（DE-3）感受态细胞表达目的蛋白,后通过Ni-NTA亲和层析法进行蛋白纯化,最终制备HBc-TIGIT EP1-2融合蛋白。（2）TIGITEP1-2修饰的重组腺病毒的包装与纯化首先利用分子克隆技术将TIGIT表位肽连入腺病毒穿梭载体pAd5/E1-CMV-H1H2-HBc-MCS-pA;同时,将TIGIT表位肽连入腺病毒骨架载体pAd5-backbone/Hexon-LacZ-MCS/E3-Luciferase-T2A-eGFP 上 Hexon 的 HVR5 区,将构建好的穿梭载体及骨架载体分别用ScaI及ClaI线性化后,共同转化至BJ5183感受态细胞中,获得重组腺病毒载体pAd5-backbone/E1-CMV-H1H2-HBc-TIGITEP1-2/Hexon-TIGITEP1-2/E3-Luciferase-T2A-eGFP。使用该载体在HEK293细胞中,进行重组腺病毒的包装、扩增及纯化,重组腺病毒命名为Ad5/E1-CMV-H1H2-HBc-TIGIT EP1-2/Hexon-TIGIT EP1-2/E3-luciferase-T2A-eGFP。3.单克隆抗体筛选抗原的表达及纯化本课题使用携带TIGITEP1-2的人颗粒蛋白前体E区（Humanprogranulin E domain,GrnE）融合蛋白作为单克隆抗体筛选抗原,构建pET-28a/GrnE-TIGIT EP1-2原核表达载体,并分别进行蛋白纯化,最终制备GrnE-TIGITEP1-2融合蛋白,作为制备针对TIGIT的单克隆抗体的筛选抗原。4.针对TIGIT表位肽的单克隆抗体的制备及鉴定使用上述两种免疫原交叉免疫BALB/c小鼠,免疫完成后,取小鼠血清检测效价,后使用杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,使用前述制备的筛选抗原筛选阳性杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。最终获得4株针对TIGITEP1的抗体及4株针对TIGITEP2的抗体。通过Western-blot、ELISA、细胞免疫荧光等实验对抗体特异性、抗体效价、抗体亚型进行鉴定。5.针对TIGIT中和性单克隆抗体筛选系统的建立及抗体的中和活性检测通过分子克隆技术获得PVR基因胞外段,然后将之连入携带CAR的慢病毒载体中,后转染HEK293细胞制备慢病毒,感染Jurkat-NFA-Luci T细胞系,使用Puromycin对细胞进行药筛,最终获得Jurkat-NFAT-Luci-PVR-CAR-T效应细胞系;同样通过分子克隆技术获得TIGIT基因胞外段,后克隆至慢病毒载体中,制备慢病毒后感染CHO细胞,经过Puro抗性筛选获得TIGIT-CHO靶细胞系。将上述效应细胞和靶细胞共孵育,效应细胞表面的PVR-CAR受体被激活,进而启动NFAT转录因子下游Luciferase的表达。在系统中加入TIGIT抗体,若抗体具有中和活性,则会阻断TIGIT与PVR结合,Jurkat细胞不能正常活化,抑制Luciferase的表达,故该系统可用于TIGIT单克隆中和活性检测。使用该系统对本课题所获得的8株抗体进行中和活性检测,结果显示,anti-TIGIT EP1 No.1-1、No.5-1、No.7-3 具有中和活性,且 anti-TIGIT EP1 No.1-1、No.7-3抗体的中和活性更高。综上所述,本课题成功筛选两个具有潜在中和活性的TIGIT抗原表位,并成功制备携带TIGIT表位肽的重组腺病毒及融合蛋白;免疫动物后,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,经过筛选与鉴定,成功获得针对TIGIT EP1的4株及针对TIGIT EP2的4株抗体;同时,本课题成功构建了灵敏、高效的TIGIT中和性抗体筛选系统,通过检测,成功筛选获得三株针对TIGIT EP1的中和性单克隆抗体。本课题以TIGIT为靶分子,设计了一套高效的制备表位抗体及灵敏的抗体中和活性检测方案,不仅为TIGIT分子机制研究提供有力工具,也为相关免疫治疗药物开发具有重要意义,同时该方案也可用于其他靶分子的抗体制备过程,有很大的应用前景。