论文部分内容阅读
目的:人脐带来源的间充质干细胞作为一种新的种子细胞来源越来越受到人们的重视。先前的研究表明从人脐带组织中分离的间充质干细胞既具有增殖能力,又具有向多细胞(神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞等)分化的能力,加之来源广泛、取材容易,在细胞移植、基因治疗、组织工程中有广阔的应用前景。然而,我们在过去四年的研究中体会到从人脐带分离间充质干细胞并非易事,特别是如何快速、高效的从脐带中获得MSC以满足基础和未来临床研究的需要是一个亟待解决的问题。为此,本课题对不同胎龄胎儿脐带和不同培养方法对分离人脐带间充质干细胞的影响进行了研究。方法:1人脐带间充质干细胞培养:(1)组织贴块法:分别取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带35例及流产胎儿脐带33例,以PBS充分冲洗,剔除脐带动、静脉,将其余的脐带间质组织切割成直径约1mm大小的组织块,在含有20%的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨(L-Glu)、100~U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的低糖型培养基(HG-DMEM)中培养,原代培养3-7天后,显微镜下可见大量细胞自组织块中游出,向外呈放射状贴壁生长。待细胞达到80%-90%汇合后,加入0.2%胰酶消化传代。收集MSCs脐带间充质干细胞后冻存待用。(2)胶原酶-胰酶消化法:分别取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带17例及流产胎儿脐带15例,超净台内取出脐带PBS充分洗涤,冲去脐静脉及动脉内的残存血,将脐带剪碎至1 mm3大小组织块,移至0.1%胶原酶Ⅳ中,37℃持续搅拌消化30 min;随即向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度为0.1%的胰酶在37℃环境中继续搅拌消化30 min;10% FBS终止消化,用细胞筛过滤,将含细胞的滤液进行离心。细胞接种于LG-DMEM培养基的T-25塑料培养瓶中。3,4 d后,更换培养基,去掉未贴壁细胞。以后每3天换液1次,至细胞融合传代。2将贴壁的干细胞消化。加入0.2%胰酶/0.2%EDTA,待细胞大部分变成圆形后,加入含有10%FBS的DMEM中止消化,吹打贴壁细胞使贴壁细胞变成悬浮状态。1000rpm离心10分钟,弃上清液,PBS洗涤(去除剩余的血清等)。室温下,1000rpm离心10分钟,台盼蓝染色法评估细胞活性,并进行细胞计数。安每管3-4×10 5分成12管各管中加入下述PE、FITC、PERCP、及APC标记的小鼠抗人单克隆抗体5ul,充分混匀,4℃避光孵育30分钟。1800rpm离心5分钟,去除上清液,加入2MLPBS 1000rpm离心两次,各5分钟。调整最终容积为200ML,上机进行流式细胞检测。同时以小鼠FITC、PE、APC、PERCP标记的IgG1作为同型对照。所用抗体包括:PE-CD13、FITC-CD14、APC-CD29、FITC-CD31、FITC-CD34、PE-CD38、PE-CD44、PERCP-CD45、APC-CD90、FITC-CD105、PE-CD133、PE-CD166、HLA-DR。结果:1组织块原代培养:足月龄脐带组约1周左右,可见细胞自组织块游出,贴壁呈放射状生长,形态较均一,呈长梭形。经10天左右达到80%-90%汇合,镜下可见细胞胞浆丰富,轴突伸长,多角状。消化后以1:2-1:3的比例传代细胞,接种约30分钟后细胞开始贴壁,6-8小时贴壁完全,传代后经换液3-5天完全汇合时镜下可见细胞排列紧密,无序生长,小月龄脐带组约4-5天左右可见细胞游出,经5天左右达到80%-90%汇合,细胞传代增殖特点与足月组相似。第2天即看见有少量形态各异的贴壁细胞,散在分布。2胶原酶-胰酶消化法:第2天即看见有少量形态各异的贴壁细胞,散在分布长梭形细胞间可见少量鹅卵石样细胞组成的集落,考虑为脐静脉内皮细胞。长梭形细胞即为MSC细胞,其形态类似于成纤维细胞,增殖能力旺盛,约1周左右时,贴壁细胞形成集落,占优势的是成纤维样细胞,此外还有脐静脉内皮细胞,至2周左右可达到80%融合,脐静脉内皮细胞生长则受到明显抑制。2.5g/L胰酶消化,传代后可得到较纯化的成纤维样细胞。3流式细胞学检测结果显示:对小月龄胎儿脐带培养的间充质干细胞进行免疫表型分析表明:CD13、CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达,本实验结果表明,UCMSCs表达间充质细胞特异性抗原标志而不表达造血干细胞、内皮细胞特异性标志。这和足月胎儿脐带流式检测结果一致。并与骨髓、脐血、胎肺等其他组织来源的MSCs流式检测结果也一致。对CD13、CD29、CD44、CD90的表达达97%以上说明细胞成分比较均一。4统计学分析结果显示:UC-MSC的原代培养中小月龄胎儿组细胞爬出、首次达80%融合时间、细胞总数达到10~6的时间及培养成功率均明显早于足月胎儿组,具有统计学意义( P < 0.05 ),传代以后的细胞增值时间相近,无统计学意义( P >0.05)。组织贴块组成功率明显高于酶源消化法,具有统计学意义( P < 0.05 )。结论:本实验中小月龄胎儿脐带培养的MSC在原代培养中周期明显较足月胎儿脐带培养的MSC短,应用组织贴块法培养成功率高于酶原消化法,可在更短时间内获的所需细胞数量。不同月龄的MSC的传代增殖特性无明显差异。脐带来源的MSC在体外易扩增纯化,增殖能力强,小月龄UCMSCs表达间充质细胞特异性抗原标志而不表达造血干细胞、内皮细胞特异性标志。这和足月胎儿UCMSCs流式检测结果一致。并与骨髓、脐血、胎肺等其他组织来源的MSCs流式检测结果也一致。