目的:自体浓缩生长因子(CGF)是继富血小板血浆(PRP)及富血小板纤维蛋白(PRF)之后的第3代自体血液提取物。相比于PRP及PRF,其内部含有的纤维蛋白或生长因子聚合度及含量更高,具有更强的促进组织再生能力。脂肪干细胞(ADSCs)是自脂肪组织中分离获取的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞,与其它来源的干细胞相比,ADSCs具有储备充足、制备简便、再生性强等诸多优点,逐渐成为组织工程学重要的种子细胞。本实验以比格犬脂肪干细胞作为研究对象,观察CGF对比格犬脂肪干细胞体外增殖及成骨向分化的影响,探讨两者联合应用于骨再生的可行性。方法:1.比格犬脂肪干细胞的分离培养选取健康的12月龄雄性比格犬,体重10~12kg,在无菌条件下制取单侧腹股沟部脂肪组织,通过酶消化法及贴壁法对比格犬脂肪干细胞进行分离、培养,收集第3代细胞用于后续实验。2.比格犬脂肪干细胞的多向分化能力鉴定脂肪干细胞贴壁后将普通培养基分别更换为成骨培养基、成脂培养基及成软骨培养基进行诱导,诱导21d后弃培养液并固定,成骨组行茜素红染色,成脂组行油红O染色,成软骨组行阿利新蓝染色。3.CGF的制备及实验分组取比格犬前肢头静脉血10mL于负压离心管内,放入Medifuge CGF离心机中,配平后按程序制备CGF,剪碎后加入条件培养基。细胞按普通培养基中是否加入CGF,分为普通培养基+CGF组(CGF组)和普通培养基组(对照组)。4.应用CCK-8法检测CGF对比格犬脂肪干细胞增殖能力的影响。5.应用碱性磷酸酶染色法检测CGF对经成骨诱导的脂肪干细胞的碱性磷酸酶活性的影响。6.应用RT-PCR法检测经成骨诱导的脂肪干细胞的I-型胶原、骨钙蛋白、RUNX-2、骨桥蛋白等成骨相关基因的表达水平。7.统计学处理所有数据采用SPSS 22.0软件进行分析,组间比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.经酶消化法及贴壁法体外分离培养的比格犬脂肪干细胞,镜下观察细胞呈长梭形,呈束状或漩涡状排列,并能够于体外稳定增殖传代。2.脂肪干细胞成骨诱导21d后行茜素红染色,镜下见大量红色矿化颗粒形成,部分区域钙结节相互融合成片状。成脂诱导21d后行油红O染色,镜下见细胞体积增大,胞质内见亮红色脂类油滴。成软骨诱导21d后行阿利新蓝染色,镜下细胞内可见蓝色胞浆。3.CCK-8法结果示:两组脂肪干细胞增殖活力正常,生长曲线均呈“S”形,第3-7天CGF组细胞增殖趋势明显高于对照组。4.碱性磷酸酶染色结果示:经成骨诱导7d后,镜下见胞质及细胞外基质均可观察到紫蓝色矿化颗粒,但无论大体还是镜下(×40、×100)观察,CGF组染色深度及矿化颗粒密度均明显大于对照组。5.RT-PCR结果示:经成骨诱导4d后CGF组细胞ALP、OCN、OPN、Runx2的mRNA水平略高于对照组,组间差异无统计学意义(P>0.05);但经成骨诱导7d后,CGF组ALP、Col-I、OCN、OPN及Runx2的mRNA水平均明显高于对照组(P<0.05)。结论:1.本实验成功自比格犬脂肪组织中分离脂肪干细胞并于体外培养传代。通过多种染色法鉴定其三向分化能力,验证了制取细胞为间充质干细胞。2.CGF能显著增强比格犬脂肪干细胞体外增殖能力。3.CGF能加强成骨培养基诱导效应,能够有效促进脂肪干细胞成骨向分化。