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研究目的:肝干细胞是存在于肝脏中的组织干细胞,与肝组织自稳态维持与损伤修复密切相关。目前,对于肝干细胞的确切身份特征仍不清楚。本课题针对C57BL/6J小鼠肝脏组织中的Lin-CD45-Sca-1-CD49f+和Lin-CD45-Sca-1+CD49f两个潜在肝干细胞亚群,对比分析了它们的分化潜能、分化细胞的糖原合成能力以及基因表达谱特征,以期了解并确定这两个细胞群的干细胞属性。研究方法:(1)小鼠肝脏单细胞悬液的制备:本课题所使用实验动物为2-3月龄的C57BL/6J小鼠。采用断颈法处死动物,获取肝脏组织,经机械剪碎、胶原酶Ⅳ消化处理和细胞筛过滤后获得肝脏单细胞悬液。(2)小鼠肝干细胞的流式分析、分选:用4种抗表面标志蛋白抗体孵育肝脏细胞,行流式细胞术分析或分选。(3)肝干细胞的体外分化与细胞免疫荧光分析:用分化培养基诱导分选所得到的靶细胞群,分别培养至7天、14天、21天,用抗标志蛋白荧光偶联抗体对其染色,在荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜下镜检。(4)糖原PAS染色:靶细胞群经诱导7天、14天或21天后,用糖原PAS染色试剂盒进行染色,在荧光倒置显微镜下镜检。(5)细胞凋亡的检测:靶细胞群经诱导培养14天、21天后,回收细胞,用Annexin V和7-AAD染色孵育,流式细胞分析细胞凋亡情况。(6)基因表达谱分析:流式分选靶细胞群,一部分靶细胞用TRIzol裂解,一部分靶细胞对其进行体外分化的培养。两周后,回收细胞,样品microarray测定由商业公司完成。对差异表达基因进行GO分析和pathway分析。(7)统计方法:采用Graphpad Prism软件对实验数据进行统计,结果以平均值±标准差表示。研究结果:(1)Lin-CD45-Sca-1-CD49f+细胞和 Lin-CD45-Sca-1+CD49f 细胞具有不同的分化潜能。分离纯化的上述两个细胞亚群在分化培养基存在下培养一周后,对分化细胞的免疫荧光鉴定分析显示,Lin-CD45-Sca-1-CD49f+细胞亚群能够分化形成肝细胞(表达ALB)和胆管上皮细胞(表达CK19),而Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞亚群只能形成肝细胞。上述细胞经诱导分化2周和3周后,我们观察到了类似的结果。(2)Lin-CD45-Sca-1-CD49f+细胞和 Lin-CD45-Sca-1+CD49f 细胞产生的肝细胞表现不同的糖原合成能力。为了解由Lin-CD45-Sca-1-CD49f+细胞和Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞分化而来的肝细胞在成熟程度或功能活性上是否存在差异,我们检查了各自分化细胞的糖原合成能力。PAS染色分析显示,Lin-CD45-Sca-1-CD49f+细胞亚群形成的肝细胞比源自Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞亚群的肝细胞呈现明显强的糖原合成能力。(3)Lin-CD45-Sca-1-CD49f+细胞和 Lin-CD45-Sca-1+CD49f 细胞具有各自特征性的基因表达谱并在分化后均发生相应的变化。Lin-CD45-Sca-1-CD49f+和Lin-CD45-Sca-1+CD49f两个细胞群间有1272个基因存在差异表达(FDR<0.05,P<0.05,Fold change≥2),其中前者上调表达的基因有663个,下调表达的基因有609个。GO分析显示,差异表达基因主要涉及细胞分化、细胞增殖和凋亡等过程。我们还分析了两个细胞群分化后基因表达谱的变化。Lin-CD45-Sca-1-CD49f细胞群相对于分化细胞共有3205个差异表达基因;而Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞群相对于其分化细胞则有4162个差异表达基因。(4)Lin-CD45-Sca-1-CD49f+ 细胞和 Lin-CD45-Sca-1+CD49f 细胞呈现不同的年龄相关性变化。新生小鼠肝脏组织中LinCD45-Sca-1-CD49f+细胞群的含量显著高于青年组、中年组、老年组;但在青年组、中年组、老年组之间无明显变化。相反,Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞群在新生小鼠肝脏组织中的含量明显低于青年组、中年组、老年组,其中又以老年组的水平最高,而青年组和中年组之间没有显著性差异。结论:本研究从分化潜能、分化细胞功能活性和基因表达特征等方面的分析结果认为,小鼠Lin-CD45-Sca-1-CD49f+和Lin-CD45-Sca-1+CD49f两个细胞群同属于肝脏干/祖细胞,但可能发挥不同的作用。这两个细胞群是否存在亲代关系亦即是否为处于不同发育阶段的前体细胞仍有待厘清。