【摘 要】
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桢楠、细叶楠、紫楠,三者木材解剖结构特征相似度极高,传统形态解剖鉴别方法无法准确区分三者,难以达到准确鉴定的效果,因此本研究采用分子标记技术识别桢楠、紫楠和细叶楠。为得到高质量的基因组DNA,构建木材DNA提取技术体系,本研究提取过程中通过增加DNA裂解液的体积、延长水浴时间、增加抽提次数和DNA的洗脱次数进行提取方法改良,再比对改良QIAGEN试剂盒法、改良TAKARA试剂盒法、改良MAGEN试
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桢楠、细叶楠、紫楠,三者木材解剖结构特征相似度极高,传统形态解剖鉴别方法无法准确区分三者,难以达到准确鉴定的效果,因此本研究采用分子标记技术识别桢楠、紫楠和细叶楠。为得到高质量的基因组DNA,构建木材DNA提取技术体系,本研究提取过程中通过增加DNA裂解液的体积、延长水浴时间、增加抽提次数和DNA的洗脱次数进行提取方法改良,再比对改良QIAGEN试剂盒法、改良TAKARA试剂盒法、改良MAGEN试剂盒法、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法、CTAB-SDS(十六烷基三甲基溴化铵-十二烷基硫酸钠)法等5种方法获得的DNA质量和浓度,筛选出较优的木材DNA提取方法;利用RAD-seq技术对提取的高质量DNA进行测序并开发单核苷酸多态性(SNP)位点,对桢楠、细叶楠和紫楠进行聚类分析;同时根据桢楠、细叶楠、紫楠特异性SNP位点设计并筛选特异性引物,达到对三者进行鉴别的目的。具体研究结果如下:(1)五种DNA提取改良方法获得的DNA质量差异明显,其中效果最差的是CTAB法,无明显条带;而CTAB-SDS法虽有条带,但不满足扩增要求;另外三种改良试剂盒法中,获得DNA的质量优良关系是:改良MAGEN试剂盒法>改良QIAGEN试剂盒法>改良TAKARA试剂盒。其中,改良MAGEN试剂盒法获取DNA的A260/280范围为1.72~1.85,平均值为1.78,且浓度范围为63.7~89.9 ng·μL-1,平均浓度为71.7ng·μL-1,符合扩增及RAD测序要求。(2)通过内切酶(Eco RI)及Illumina测序平台对29个样品进行酶切建库测序,并对测序数据进行统计、剪切及过滤,获得的reads和bases数量丰富,碱基错误率极低,同时得到31777个高质量SNP标记。(3)聚类分析和PCA(Principal components analysis,PCA)分析结果显示桢楠、细叶楠、紫楠三个树种能够形成独立的支系,与传统解剖学分类结果是一致的,说明此聚类分析可准确区分同属不同种的树种;同时桢楠和细叶楠的距离很近,说明桢楠和细叶楠的亲缘关系更紧密;其中都江堰桢楠聚在一起,雅安桢楠聚为一起,说明同种不同产地的物种,也能有一定差别。(4)对桢楠、细叶楠、紫楠的候选序列进行blast对比,并针对候选序列设计整体质量最高的引物,用于后续验证。桢楠、细叶楠和紫楠分别得到的特异序列条数为4条、21条和44条。根据桢楠特异性片段设计的特异性引物的Tm温度范围:50℃-62℃。中间温度为57.7℃~54.6℃时,扩增效果都比较好,目的条带特异性高、丰度好,确定退火温度为55℃。(5)桢楠和紫楠的特异引物的特异性不佳,不能完全将三者区分开来。而根据细叶楠特异性片段设计的特异引物XYNP02((F:5’-TGAATGCCCCTAACTC AGCT-3’;R:5’-TTCTCACTCCCACTCCCACT-3’))能将紫楠与桢楠或细叶楠区分开来,但不能区分桢楠和细叶楠。
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