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昆虫依靠其灵敏特异的嗅觉系统去识别周围环境中复杂气味分子,从而引导昆虫的一系列行为,如交配、寄主定位、产卵地选择等。在对气味分子的识别过程中涉及到多种蛋白的参与,主要包括气味受体(odorant receptors,ORs)、离子型受体(ionotropic receptors,IRs)、气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)和神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)。因此对嗅觉基因的研究有助于深入了解昆虫嗅觉识别的分子机制。柑橘大实蝇(Bactrocera minax)是柑橘类作物毁灭性害虫,主要发生在中国以及印度等国家,同时也是重要的世界性检疫害虫。为了掌握柑橘大实蝇这类经济重要害虫的嗅觉系统,我们对其成虫触角和足的转录组进行了研究,分析了嗅觉基因在触角和足中的表达模式,再结合进化树分析结果选取4个普通气味受体基因进行功能研究。主要结果如下:1、柑橘大实蝇转录组分析和嗅觉基因鉴定本研究在Illumina Hi Seq 2500的测序平台下,对柑橘大实蝇雌雄触角和足共计12个样品进行转录组测序,分别获得73.60 Mb,73.60Mb,73.96 Mb,74.07 Mb,71.57 Mb,74.24 Mb,74.30 Mb,74.70 Mb,74.43 Mb,73.97 Mb,73.46 Mb和74.61 Mb的clean reads。组装之后分别获得42,281,38,540,41,909,42,019,41,584,43,952,35,953,36,572,34,810,33,967,32,538和32,622个unigenes,在进行同源聚类后,得到的总unigene数量为72,013,平均长度、N50和GC含量分别为1,734 bp,3,855 bp和37.43%。在对转录组进行注释和分析后,总共鉴定了122个嗅觉基因,其中包括59个Bmin ORs,16个Bmin IRs,39个Bmin OBPs,5个Bmin CSPs和3个Bmin SNMPs。2、柑橘大实蝇嗅觉基因在触角和足中的表达模式分析利用FPKM值评估柑橘大实蝇所有嗅觉基因(Bmin ORs,Bmin IRs,Bmin OBPs,Bmin CSPs和Bmin SNMPs)在雌雄触角和足中的表达水平。在Bmin ORs基因中,绝大部分基因在雌雄触角高表达,其中Bmin Orco的表达量最高,而Bmin OR2在雌雄足中也有相应的表达。在Bmin IRs基因中,9个Bmin IRs(Bmin IR93a,Bmin IR25a,Bmin IR76a,Bmin IR84a,Bmin IR76b,Bmin IR75d,Bmin IR8a,Bmin IR41a,和Bmin IR92a.4)在雌雄触角高表达,其中,3个Bmin IRs(Bmin IR93a,Bmin IR25a和Bmin IR75d)基因在雌雄足中也有表达。在Bmin OBPs基因中,大部分Bmin OBPs基因都是在雌雄触角高表达,其中也有13个Bmin OBPs(Bmin OBP27,Bmin OBP33,Bmin OBP7,Bmin OBP20,Bmin OBP5,Bmin OBP24,Bmin OBP16,Bmin OBP21,Bmin OBP13,Bmin OBP3,Bmin OBP35,Bmin OBP2和Bmin OBP12)基因在雌雄足中高表达。在Bmin CSPs基因中,Bmin CSP2和Bmin CSP3在雌雄触角中高表达,其中Bmin CSP1不仅在雌雄触角高表达,同时也在雌雄足中高表达。在Bmin SNMPs基因中,Bmin SNMP1和Bmin SNMP3在雌雄触角中高表达。对于柑橘大实蝇所有嗅觉基因Bmin ORs,Bmin IRs,Bmin OBPs,Bmin CSPs和Bmin SNMPs在雌雄触角中差异表达的显著性分析结果表明,没有任何嗅觉基因在雌雄触角中具有显著性差异表达。利用RT-PCR实验验证嗅觉识别的关键基因Bmin ORs(59个)在柑橘大实蝇雌雄触角和足中的表达模式。所有的Bmin ORs基因都在雌雄触角中表达,其中,有4个Bmin ORs(Bmin OR26,Bmin OR49,Bmin OR50和Bmin OR55)基因在雌雄足中也有表达,7个Bmin ORs(Bmin Orco,Bmin OR12,Bmin OR14,Bmin OR16,Bmin OR24,Bmin OR45和Bmin OR58)基因在雌雄触角高表达,并且雌雄之间的表达量没有差异,7个Bmin ORs(Bmin OR5,Bmin OR6,Bmin OR10,Bmin OR26,Bmin OR34,Bmin OR50和Bmin OR57)基因在雄虫触角的表达量要高于雌虫触角,Bmin OR49在雌雄足的表达量要高于雌雄触角。3、柑橘大实蝇气味受体的克隆和功能研究根据转录组分析结果,从柑橘大实蝇触角克隆得到4个气味受体基因(Bmin OR3,Bmin OR12,Bmin OR16和Bmin OR24)。利用RT-PCR实验方法对Bmin OR3,Bmin OR12,Bmin OR16和Bmin OR24在柑橘大实蝇雌雄成虫组织的表达模式进行分析。结果表明,Bmin OR3,Bmin OR12,Bmin OR16和Bmin OR24仅在触角中高表达,并且雌雄之间没有明显差异,其中,Bmin OR12,Bmin OR16和Bmin OR24基因在雌雄触角的表达量要明显高于Bmin OR3基因。将Bmin OR3,Bmin OR12,Bmin OR16和Bmin OR24分别与Bmin Orco混合注射至非洲爪蟾卵母细胞中进行共表达,并利用双电极电压钳系统进行记录。研究结果表明,4个Bmin ORs都能被至少一种植物挥发物激活。其中,Bmin OR3/Bmin Orco仅对1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)的刺激具有强烈的电生理反应;Bmin OR12/Bmin Orco对八种植物挥发物的刺激具有电生理反应,分别是苯甲醇(benzyl alcohol),香芹酮((S)-(+)-carvone),丙酸丁酯(butyl propionate),1-辛醇(1-octanol),丙烯酸丁酯(butyl acrylate),乙酸叶醇酯((Z)-3-hexenyl acetate),苯甲醛(benzaldehyde),和水杨酸甲酯(methyl salicylate);Bmin OR16/Bmin Orco仅对十一醇(undecanol)具有微弱的电生理反应;Bmin OR24/Bmin Orco对芳樟醇(linalool)的刺激具有较强的电生理反应,与此同时也对甲基丁香酚(methyl eugenol)具有微弱的电生理反应。而在行为学实验中,柑橘大实蝇雌虫对浓度为1μg/μL的1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)没有行为影响。