目 的 (1)观察用神经毒素 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine , MPTP)制作的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)鼠模型中是否有核因子-κB(nuclear factor-κappaB,NF-κB)的表达和活化。 (2)观察用神经毒素 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶制作的帕金森病鼠模型中核因子-κB 对鼠 PD 发生和发展的影响。 (3)观察在每次注射神经毒素 MPTP 制作帕金森病鼠模型前,使用 核 因 子 - κ B 抑 制 剂 二 硫 代 氨 基 甲 酸 吡 咯 烷 ( pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)对黑质致密部(SNpc)多巴胺能神经元的影响。 方 法 采用 60 只正常健康的 8～12 周龄,雄性 C57/BL 小鼠,随机分成 4个实验组(test group, TG),4 个预防组(prevention group, PG),4个正常组(normal group, NG) ,每组 5 只,均同期同等喂养:4 个实验组用 MPTP 30mg/kg/d(用 0.9%生理盐水配制)鼠腹膜内注射,分别持续处理共 1,3,7,14 天,每天一次(间隔 24 小时),为帕金森病鼠模型重庆医科大学硕士研究生学位论文 3组;4 个预防组用 PDTC 40mg/kg/d(用 0.9%生理盐水配制)鼠腹膜内注射,半小时后 MPTP 30mg/kg/d 鼠腹膜内注射,分别持续处理共 1,3,7,14天,每天一次(间隔 24 小时);4 个正常组用等量的 0.9%生理盐水鼠腹膜内注射,分别持续处理共 1,3,7,14 天,每天一次(间隔 24 小时)。处理前采用行为学方法了解 C57/BL 小鼠的爬杆时间,观察是否出现帕金森病样异常行为,各组小鼠处理后仍采用行为学方法了解 C57/BL 小鼠的爬杆时间,观察是否出现帕金森病样异常行为,采用链霉卵白素-生物素-过氧化物酶复合法,即 SABC 免疫组织化学法原位检测了解黑质区 NF-κB p65 蛋白的表达、NF-κB p65 阳性细胞数、NF-κB 核转位现象、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元及神经纤维计数,并在形态学上采用 Pischingert 氏亚甲基蓝染色法(尼氏体染色)及 HE 染色(神经病理)等方法观察黑质细胞丢失现象,从黑质 NF-κB p65 蛋白质表达,NF-κB p65 阳性细胞数,NF-κB 核转位现象,TH 阳性神经元及神经纤维计数,以及行为学、形态学方法等多层次,多角度来了解 NF-κB 与帕金森病的可能关系。结 果 (1)行为学观察结果:实验组、预防组及正常组之间各组小鼠爬杆时间差在处理第一次后均无显著性差异(p>0.05),各组小鼠均未出现前肢抬举、震颤、动作迟缓等帕金森病样异常行为。在处理第三次,七次,十四次后,实验组小鼠爬杆时间差比相应的预防组及正常组小鼠均显著增加,具有显著性差异(p<0.05),实验组小鼠于神经毒素 MPTP 第三次注射后就有开始出现短暂的帕金森病样异常行为。以重庆医科大学硕士研究生学位论文 4后每次注射后, 帕金森病样异常行为表现愈来愈明显,持续时间也越来越长。预防组小鼠爬杆时间差与相应的正常组小鼠相比均无显著性差异(p>0.05),预防组及正常组小鼠均未出现帕金森病样异常行为 。(2)SABC 免疫组化法结果:①NF-kB 免疫组化结果: 在处理第一次后,实验组、预防组及正常组三组黑质区均有 NF-κB 表达,NF-κB蛋白阳性表达定位于细胞浆,呈黄褐色,强阳性者细胞核内也有表达,但预防组及正常组仅有极少数阳性细胞,无明显核转位现象。实验组有较多的阳性细胞,胞浆呈黄褐色,并且有核转位现象,表现为核亦呈黄褐色,苏木素不能复染。实验组平均光密度值(MOD)、积分光密度值(IOD)、 阳性细胞数(CPC)及 NF-kB 核细胞转位数(CDN)分别与正常组、预防组相比均有显著性差异(p<0.01)。在处理第三次,七次,十四次后,各实验组、预防组及正常组小鼠亦均有 NF-κB 表达,但正常组仅有极少数阳性细胞,无核转位现象,实验组有较多的阳性细胞,并且有明显核转位现象。预防组阳性细胞比实验组显著减少,有少量核转位现象。经统计学检验实验组 NF-κB 蛋白 MOD、IOD、CPC 及 CDN分别与相应的正常组、预防组相比也均有极其显著性差异(p<0.01)。实验组小鼠随着处理次数增加,小鼠黑质区 NF-kappaB 蛋白表达也随之增加。预防组小鼠随着处理次数增加,小鼠黑质区的 NF-kappaB 蛋白 MOD、IOD 也随之增加,但是,NF-kappaB 蛋白阳性细胞数及 NF-kB核细胞转位数并不随之增加。各时间点正常组小鼠随着处理次数增加,小鼠黑质区 NF-kappaB 蛋白表达并不随之增加,而是保持某一恒定水平。实验组在处理第三次,七次,十四次后与处理第一次后相比较黑重庆医科大学硕士研究生学位论文 5质区的 NF-kappaB 蛋白 MOD、IOD、CPC 及 CDN 分别统计学检验均有显著性差异(p<0.01)。正常组、预防组在处理第三次,七次,十四次后与处理第一次后相比较黑质区的 NF-kappaB 蛋白平均光密度值、积分光密度值、 阳性细胞数及 NF-kB 核细胞转位数分别统计学检验均无显著性差异(p>0.05)。实验组与预防组相比较黑质区的 NF-kappaB蛋白增加更加明显,速度更快。② TH 免疫组化结果: 在处理第一次后,实验组、预防组及正常组在黑质区均有 TH 阳性细胞表达,TH 阳性表达定位于细胞浆,呈黄褐色,实验组及预防组阳性细胞与正常组比较均无明显减少,实验组、