长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析

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睾丸发育、精子生成过程涉及生殖细胞、间质细胞和支持细胞在内的多种细胞协同作用,该过程受到极其复杂和严格的分子时空调控,人们对其理解仍十分有限。环状RNA作为一类新的长链非编码RNA存在于人和牛等动物的睾丸及精清中,可能参与调控睾丸发育及精子发生过程。然而,公猪睾丸组织发育成熟过程中环状RNA的表达谱及其潜在生物学功能尚不清楚。N6-甲基腺苷(m6A)修饰是存在于RNA内部最常见的一类修饰,参与调控细胞分化、个体发育等多种生理病理进程,但关于m6A与睾丸发育、精子发生之间的关系目前仍知之甚少。因此,本文选取性成熟前后两个不同发育阶段的长白公猪睾丸组织,利用高通量测序技术和生物信息学等手段,揭示不同阶段睾丸中的环状RNA和m6A表达特征并比较分析其表达差异,预测和解析差异表达的环状RNA、m6A修饰在睾丸发育和精子发生事件中的潜在生物学功能,为增进了解环状RNA、m6A修饰参与公猪精子发生、睾丸发育调控等提供新的线索。本论文得到研究结果如下:本研究对未成年(30日龄,D30)和性成熟(210日龄,D210)长白公猪睾丸进行组织形态学观察。H&E染色结果显示,30日龄长白公猪睾丸曲细精管尚未发育完整,睾丸内未见明显管腔,处于性成熟前阶段;210日龄长白公猪睾丸体积显著增大,曲细精管发育完全,内含大量不同类型的生殖细胞并产生大量圆形精子及长形精子,已达到性成熟后阶段。使用去除核糖体RNA及线性RNA的总RNA-Seq来检测D30和D210长白公猪睾丸组织中环状RNA的表达谱。高通量测序显示睾丸组织中含有丰富的环状RNA,性成熟前后睾丸中分别鉴定出34521与31803个环状RNA。生物信息学分析发现这些环状RNA广泛分布于常染色体和性染色体上,长度主要位于100~10000 nt之间(58.97%),主要来源于源头基因的外显子区域,大部分环状RNA由1-7个外显子形成(86.54%),并且部分源头基因可以产生多个环状RNA。在公猪睾丸成熟过程中共发现来源于1526个源头基因的2326个差异表达的环状RNA,其中1003个D210公猪睾丸组织中上调,1323个下调。此外,差异表达的环状RNA源头基因GO功能分析显示这些环状RNA主要与精子发生、激素生物合成过程的正调控、生殖细胞发育、雄性减数分裂等生物过程有关。KEGG通路富集分析发现他们分别参与了干细胞多能性调节、紧密连接、粘附连接、cAMP等信号通路。因此,以上结果表明性成熟前后公猪睾丸表达大量的环状RNA,这些环状RNA呈现发育阶段特异性的动态表达模式,且主要与睾丸发育、精子发生等生物学过程密切相关。这些结果将有望为鉴定种公猪睾丸发育状态及筛选优秀种公猪提供一种潜在的分子标记物。同时为了研究睾丸发育成熟过程中m6A甲基化修饰的动态变化,本研究绘制了长白猪性成熟前后睾丸转录组范围信使RNA m6A甲基化图谱。本研究描述了m6A甲基化修饰在睾丸发育过程中的广泛分布模式,并分析了基因表达与m6A甲基化修饰的关系,同时广泛地鉴定了性成熟前后m6A甲基化修饰差异基因,这些基因可能与睾丸的生物学功能的密切相关。这些结果为确定睾丸中mRNA m6A甲基化的存在及其图谱提供了依据,并扩展了对m6A在哺乳动物器官发育和生长中作用的认识。
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