本论文共包括两部分,第一部分：乳腺癌中Vavl蛋白的调控机制和功能；第二部分：激酶PKR抑制肽的筛选。第一部分：乳腺癌是女性中致死率最高的癌症。据报道,乳腺癌的发生发展和持久的曝露于雌激素环境有关。雌激素受体(estrogen receptor, ER)的表达和响应被视为乳腺癌分类和预后的重要分子标志之一。雌激素受体有两种亚型,分别是ERa和ERβ。ERa多表达有乳腺和子宫,而ERp具有更广泛的表达分布,其还表达于前列腺、卵巢、肺和脾脏。雌激素能够以配体形式结合雌激素受体,并引起雌激素受体构象发生变化,使之激活。激活的雌激素受体或通过结合靶基因启动上的雌激素反应元件(estrogen response element, ERE),或通过结合启动子上其他的转录因子,如AP1、SPl和E2F1,调控大量基因的表达,从而发挥调控细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡的作用。Vavl最初因其缺失N端后在NIH3T3纤维细胞中的转化作用而被认为是一个原癌基因,随后被鉴定为造血细胞特异性的鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF)。一系列的研究表明,Vavl是一个具有多功能结构域的蛋白,它不仅能够以GEF活性依赖的形式激活RhoGTPase参与淋巴细胞的细胞骨架重组,还能以非GEF活性依赖的形式在T细胞中参与众多的细胞过程,如钙离子动员。同时,越来越多的证据表明,Vav1蛋白也能够在非造血细胞中表达,而且和几种人类恶性肿瘤相关,如神经母细胞瘤、肺癌和胰腺导管腺癌。功能研究发现,在肺癌和胰腺导管腺癌中沉默vav1表达能够减少细胞增殖,而且也能够减少在裸鼠中肿瘤的大小。另外,Vav1呈阳性的胰腺癌病人比Vavl呈阴性的病人展示出较差的预后效果以及较低的生存率。这些证据说明,Vavl蛋白的异常表达可能对人们癌症的发生发展具有重要的作用。近来,已有文献报道在乳腺癌样本中检测到了Vavl的异常表达。本研究中,我们试图探讨在乳腺癌细胞中Vavl表达的机制及其功能。我们首先用实时定量PCR (Quantitative real time PCR, qRT-PCR)的方法在乳腺癌样本中确认了Vav1异常表达这一结论。同时我们也用Western Blot的方法在两种ER阳性的乳腺癌细胞系中检测到了Vav1的表达。继而我们发现,在乳腺癌细胞中,雌激素以一种时间梯度和浓度梯度依赖的方式通过雌激素受体a亚型上调vav1基因的转录水平和蛋白表达。进一步地,我们通过报告基因、染色体免疫共沉淀和蛋白免疫沉淀等手段发现了ERa通过结合vavl基因启动子上的转录因子c-Myb和ELF-1与vavl基因启动子相互作用行使对vavl基因转录的调控作用。最后,我们发现在乳腺癌细胞中沉默vavl表达,能够抑制细胞周期蛋白Cyclin D1的表达和E2诱导的细胞周期进程,同时也发现,Vavl过表达能够促进乳腺癌细胞的细胞增殖。这些证据表明,雌激素可能部分地通过上调Vavl的表达来调控乳腺癌的细胞增殖。第二部分：双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)属于真核翻译起始因子eIF2α激酶家族,它通过磷酸化底物eIF2a使蛋白合成终止。PKR主要参与宿主对病毒感染的固有免疫反应,同时也在信号转导、细胞生长、分化和凋亡的控制中起重要作用。PKR活性过高会导致免疫过激的病理反应。最近证实老年痴呆症中PKR的异常激活导致神经元的调亡。因此,PKR激酶的抑制剂在多种疾病的治疗上有很好的应用潜力和价值,是一个被很多人关注的领域。我们应用噬菌体展示12肽库筛选PKR激酶结构域结合多肽,得到一系列PKR结合多肽。我对结合能力较强的三个(P1,P2和P3)在胞内和胞外进行了分析,发现其中的两个能够抑制PKR催化eIF2α磷酸化的激酶活性,但却不影响PKR的激活。动力学分析显示,其中多肽P1为底物竞争性抑制剂,而多肽P2具有复合型的抑制形式。