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目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)为常见于中老年的神经退行性疾病,其主要病理改变为黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)神经元的变性及其导致纹状体(striatum,Str)内神经递质DA的耗竭,目前尚无可取得满意疗效的治疗手段。随着近年细胞生物学研究的不断深入,神经细胞移植技术日益受到人们的关注。由于PD病变区域较为局限,被认为是神经细胞移植治疗最有希望治愈的中枢神经系统疾患之一。尽管已有研究证实移植DA神经元可改善PD动物的运动症状,然而由于机体局部微环境的影响,导致移植DA神经元存活率较低,使其难以取得稳定的疗效。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)作为神经组织特异性的前体细胞,具有来源丰富,增殖、分化能力强,能整合于宿主细胞,极低或无免疫源性,无致瘤性等特点,为PD的细胞移植治疗的带来新的希望。最近研究表明,源于胚胎中枢神经系统各区域的NSCs具有不同的分化潜能,中脑来源的NSCs(mesencephalic neural stem cells,mNSCs)更易于分化为DA神经元,是细胞移植治疗PD的理想细胞源。然而由于机体局部微环境的影响,仅少量mNSCs可在体内分化为DA神经元。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)是目前发现最强的DA神经营养因子,然而由于血脑屏障和脑组织结构的特点,使其应用受到了限制。随着现代分子细胞生物学技术的发展,基因治疗为解决GDNF给药途径问题带来新的希望。综上所述,为取得理想的疗效,PD的细胞移植治疗不仅需要替代局部缺失的DA神经元,更需要改善机体局部微环境,使其有利于移植细胞的存活、生长并向DA神经元分化。因此,本研究拟将DA神经元、mNSCs的移植替代作用和GDNF的DA神经营养作用相结合,探讨GDNF基因修饰大鼠胚胎mNSCs联合DA神经元移植对PD模型大鼠的治疗作用,为PD的细胞移植治疗提供新的思路。方法1.从U-251细胞总RNA中扩增GDNF编码序列,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1构建重组质粒pEGFPN1-GDNF,经酶切鉴定及序列分析后,以FuGeneHD转染试剂介导转染COS-7细胞,应用RT-PCR、western blot和免疫细胞化学鉴定GDNF在细胞内的表达。2.解剖分离E14d大鼠胚胎腹侧中脑组织,经机械吹打制成单细胞悬液,接种于无血清培养基中培养,观察其增殖、分化并进行Nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后β-Ⅲ-tubulin、GFAP、CNPase免疫细胞化学鉴定。3.采用核转染技术将重组质粒pEGFPN1-GDNF转入大鼠胚胎mNSCs,经G418筛选建立GDNF基因修饰大鼠胚胎mNSCs;以FuGene HD转染试剂介导超顺磁氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)标记GDNF基因修饰mNSCs;应用RT-PCR、western blot和免疫细胞化学鉴定GDNF在GDNF基因修饰mNSCs中的表达;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记;体外诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力。4.分离培养大鼠胚胎中脑DA神经元:应用RT-PCR鉴定DA神经元标志基因的表达;β-Ⅲ-tubulin、TH免疫细胞化学鉴定的其纯度。5.中脑背盖腹侧区(ventral tegmental area,VTA)、内侧前脑束立(medial forbrainbundle,MFB)体定向注射6-OHDA建立PD模型大鼠。将PD模型大鼠随机分为DA神经元移植组、GFP基因修饰mNSCs移植组、GDNF基因修饰mNSCs移植组、GFP基因修饰mNSCs联合DA神经元移植组、GDNF基因修饰mNSCs联合DA神经元移植组和对照组;利用立体定向技术,将相应细胞移植到PD大鼠纹状体区。通过阿朴吗啡(APO)诱导PD大鼠旋转行为评估细胞移植的治疗作用。6.应用磁共振成像观察移植SPIO标记mNSCs在PD大鼠纹状体内的存活和迁移情况;免疫荧光组织化学研究移植mNSCs在PD大鼠纹状体内的存活、迁移和分化。结果1.重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650 bp和4700 bp的片段,测序分析结果证实DNA插入片段与文献报道完全一致。重组质粒pEGFPN1-GDNF转染COS-7细胞后,RT-PCR、western blot和免疫细胞化学结果证实GDNF能在COS-7细胞中正确表达。2.大鼠胚胎mNSCs原代培养7 d后,可形成大量悬浮生长巢蛋白(nestin)免疫阳性的神经球,经诱导分化后细胞呈微管蛋白β-3(β-Ⅲ-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)或2’,3’-环腺苷酸-3’-磷酸二酯酶(2’.3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase,CNPase)免疫阳性。3.重组质粒pEGFPN1-GDNF转染第三代大鼠胚胎mNSCs后,RT-PCR、westernblot和免疫细胞化学证实GDNF能在mNSCs中正确表达;普鲁士蓝染色、透射电镜证实SPIO成功标记GDNF基因修饰mNSCs;体外诱导分化研究表明GDNF基因修饰及SPIO标记不影响mNSCs的增殖和分化。4.大鼠胚胎DA神经元于体外培养7-11d细胞生长最为旺盛;RT-PCR结果显示细胞表达Nurrl、lmxlb和TH等DA神经元标志基因;免疫细胞化学表明分离培养的DA神经元纯度达85.7%。5.APO诱导大鼠旋转行为学评估证实成功建立偏侧PD大鼠模型,成模率达55.7%。细胞移植后APO诱导大鼠旋转行为学评估显示:与对照组相比,细胞移植能显著改善APO诱导PD大鼠的异常旋转行为(P＜0.01),以GDNF基因修饰mNSCs联合DA神经元移植疗效最为明显,细胞移植后旋转圈数下降到移植前的24%(P＜0.01)。6.磁共振T2 FFE扫描图像显示SPIO标记细胞移植区呈低信号改变,随时间延长可见低信号区向周围扩大。普鲁士蓝染色结果显示,各组PD大鼠纹状体内可见大量SPIO标记细胞停留于移植原位,仅有少数细胞向周围脑组织迁移。8.免疫荧光组织化学染色结果显示:各细胞移植组纹状体内可见大量细胞停留于移植原位,仅有少数细胞向周围脑组织迁移;移植后大多数mNSCs仍保持其未分化状态或分化为神经胶质细胞,仅少数细胞可分化为DA神经元;与其它各组相比,GDNF基因修饰mNSCs联合DA神经元移植组有更多的mNSCs分化为DA神经元。结论1.成功建立了GDNF真核表达质粒pEGFPN1-GDNF和GDNF基因修饰mNSCs。2.SPIO可用于体外标记mNSCs,通过MRI成像可对脑内移植的SPIO标记细胞进行初步活体示踪。3.与mNSCs或DA神经元单纯移植相比,GDNF基因修饰mNSCs联合DA神经元移植可显著改善PD大鼠的异常行为,但其作用机制有待进一步研究。