神经干细胞联合多巴胺神经元移植治疗帕金森病的实验研究

被引量 : 2次 | 上传用户:heiyun28
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)为常见于中老年的神经退行性疾病,其主要病理改变为黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)神经元的变性及其导致纹状体(striatum,Str)内神经递质DA的耗竭,目前尚无可取得满意疗效的治疗手段。随着近年细胞生物学研究的不断深入,神经细胞移植技术日益受到人们的关注。由于PD病变区域较为局限,被认为是神经细胞移植治疗最有希望治愈的中枢神经系统疾患之一。尽管已有研究证实移植DA神经元可改善PD动物的运动症状,然而由于机体局部微环境的影响,导致移植DA神经元存活率较低,使其难以取得稳定的疗效。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)作为神经组织特异性的前体细胞,具有来源丰富,增殖、分化能力强,能整合于宿主细胞,极低或无免疫源性,无致瘤性等特点,为PD的细胞移植治疗的带来新的希望。最近研究表明,源于胚胎中枢神经系统各区域的NSCs具有不同的分化潜能,中脑来源的NSCs(mesencephalic neural stem cells,mNSCs)更易于分化为DA神经元,是细胞移植治疗PD的理想细胞源。然而由于机体局部微环境的影响,仅少量mNSCs可在体内分化为DA神经元。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)是目前发现最强的DA神经营养因子,然而由于血脑屏障和脑组织结构的特点,使其应用受到了限制。随着现代分子细胞生物学技术的发展,基因治疗为解决GDNF给药途径问题带来新的希望。综上所述,为取得理想的疗效,PD的细胞移植治疗不仅需要替代局部缺失的DA神经元,更需要改善机体局部微环境,使其有利于移植细胞的存活、生长并向DA神经元分化。因此,本研究拟将DA神经元、mNSCs的移植替代作用和GDNF的DA神经营养作用相结合,探讨GDNF基因修饰大鼠胚胎mNSCs联合DA神经元移植对PD模型大鼠的治疗作用,为PD的细胞移植治疗提供新的思路。方法1.从U-251细胞总RNA中扩增GDNF编码序列,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1构建重组质粒pEGFPN1-GDNF,经酶切鉴定及序列分析后,以FuGeneHD转染试剂介导转染COS-7细胞,应用RT-PCR、western blot和免疫细胞化学鉴定GDNF在细胞内的表达。2.解剖分离E14d大鼠胚胎腹侧中脑组织,经机械吹打制成单细胞悬液,接种于无血清培养基中培养,观察其增殖、分化并进行Nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后β-Ⅲ-tubulin、GFAP、CNPase免疫细胞化学鉴定。3.采用核转染技术将重组质粒pEGFPN1-GDNF转入大鼠胚胎mNSCs,经G418筛选建立GDNF基因修饰大鼠胚胎mNSCs;以FuGene HD转染试剂介导超顺磁氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)标记GDNF基因修饰mNSCs;应用RT-PCR、western blot和免疫细胞化学鉴定GDNF在GDNF基因修饰mNSCs中的表达;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记;体外诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力。4.分离培养大鼠胚胎中脑DA神经元:应用RT-PCR鉴定DA神经元标志基因的表达;β-Ⅲ-tubulin、TH免疫细胞化学鉴定的其纯度。5.中脑背盖腹侧区(ventral tegmental area,VTA)、内侧前脑束立(medial forbrainbundle,MFB)体定向注射6-OHDA建立PD模型大鼠。将PD模型大鼠随机分为DA神经元移植组、GFP基因修饰mNSCs移植组、GDNF基因修饰mNSCs移植组、GFP基因修饰mNSCs联合DA神经元移植组、GDNF基因修饰mNSCs联合DA神经元移植组和对照组;利用立体定向技术,将相应细胞移植到PD大鼠纹状体区。通过阿朴吗啡(APO)诱导PD大鼠旋转行为评估细胞移植的治疗作用。6.应用磁共振成像观察移植SPIO标记mNSCs在PD大鼠纹状体内的存活和迁移情况;免疫荧光组织化学研究移植mNSCs在PD大鼠纹状体内的存活、迁移和分化。结果1.重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650 bp和4700 bp的片段,测序分析结果证实DNA插入片段与文献报道完全一致。重组质粒pEGFPN1-GDNF转染COS-7细胞后,RT-PCR、western blot和免疫细胞化学结果证实GDNF能在COS-7细胞中正确表达。2.大鼠胚胎mNSCs原代培养7 d后,可形成大量悬浮生长巢蛋白(nestin)免疫阳性的神经球,经诱导分化后细胞呈微管蛋白β-3(β-Ⅲ-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)或2’,3’-环腺苷酸-3’-磷酸二酯酶(2’.3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase,CNPase)免疫阳性。3.重组质粒pEGFPN1-GDNF转染第三代大鼠胚胎mNSCs后,RT-PCR、westernblot和免疫细胞化学证实GDNF能在mNSCs中正确表达;普鲁士蓝染色、透射电镜证实SPIO成功标记GDNF基因修饰mNSCs;体外诱导分化研究表明GDNF基因修饰及SPIO标记不影响mNSCs的增殖和分化。4.大鼠胚胎DA神经元于体外培养7-11d细胞生长最为旺盛;RT-PCR结果显示细胞表达Nurrl、lmxlb和TH等DA神经元标志基因;免疫细胞化学表明分离培养的DA神经元纯度达85.7%。5.APO诱导大鼠旋转行为学评估证实成功建立偏侧PD大鼠模型,成模率达55.7%。细胞移植后APO诱导大鼠旋转行为学评估显示:与对照组相比,细胞移植能显著改善APO诱导PD大鼠的异常旋转行为(P<0.01),以GDNF基因修饰mNSCs联合DA神经元移植疗效最为明显,细胞移植后旋转圈数下降到移植前的24%(P<0.01)。6.磁共振T2 FFE扫描图像显示SPIO标记细胞移植区呈低信号改变,随时间延长可见低信号区向周围扩大。普鲁士蓝染色结果显示,各组PD大鼠纹状体内可见大量SPIO标记细胞停留于移植原位,仅有少数细胞向周围脑组织迁移。8.免疫荧光组织化学染色结果显示:各细胞移植组纹状体内可见大量细胞停留于移植原位,仅有少数细胞向周围脑组织迁移;移植后大多数mNSCs仍保持其未分化状态或分化为神经胶质细胞,仅少数细胞可分化为DA神经元;与其它各组相比,GDNF基因修饰mNSCs联合DA神经元移植组有更多的mNSCs分化为DA神经元。结论1.成功建立了GDNF真核表达质粒pEGFPN1-GDNF和GDNF基因修饰mNSCs。2.SPIO可用于体外标记mNSCs,通过MRI成像可对脑内移植的SPIO标记细胞进行初步活体示踪。3.与mNSCs或DA神经元单纯移植相比,GDNF基因修饰mNSCs联合DA神经元移植可显著改善PD大鼠的异常行为,但其作用机制有待进一步研究。
其他文献
聚氯化铝(PAC)作为一种无机高分子混凝剂已广泛应用于水质净化和污水处理。我国粉煤灰资源非常丰富,但利用率低。由于粉煤灰中含有一定比例的Al元素,因此是制备聚氯化铝的廉价
传统的有机电致荧光发光材料只能利用单线态激子进行发光,根据自旋统计理论,单线态激子和三线态激子形成的比例通常为1∶3。也就是说荧光发光材料内量子效率理论上最高只能为
对电镀镍磷合金的镀液成份及镀覆条件、电沉积机理和非晶态形成条件、镀层的物相结构及测定方法、镀层性能和耐蚀机理等方面的研究现状进行了综述,并概要介绍了其应用前景。
包头市是内蒙古自治区实力最强、基础设施条件最好、规模最大的城市;作为内蒙地区的工业重镇,拥有全区最大的工业基地和商品市场,具有相对雄厚的工业基础和综合性加工工业基
在2007年的《政府工作报告》中,温家宝总理指出今年加强就业和社会保障工作的主要措施是:“实施有利于促进就业的财政、税收和金融政策,积极支持自主创业和自谋职业,加强社会
风险理论研究是近年来学界关注的新课题之一,取得了不少有价值的研究成果,但是很少有关于制度风险的研究,从而造成了现代性制度风险的理论研究远远落后于制度建设实践。文章
<正>国内外大多数研究显示羟基磷灰石具有良好的生物相容性和生物活性,医学领域的运用中,普通羟基磷灰石的缺点是脆性大,有很多研究显示纳米羟基磷灰石有更高的强度和韧性,纳
风险是指在某一特定环境下,在某一特定时间段内,某种损失发生的可能性。风险是由风险因素、风险事故和风险损失等要素组成。换句话说,是在某一个特定时间段里,人们所期望达到
由光未然作词,冼星海作曲的《黄河大合唱》,是一部反映中华民族抗日救国战争的音乐史诗。曾激励着中华儿女不屈不挠,英勇抗战,堪称中华民族的英雄史诗。它是一部高度概括抗日
在研究生教育中,建设和造就一支创新型的研究生导师队伍,直接关系到高素质、高层次创新型人才的培养。研究生指导教师的有效考核和评价有助于对研究生指导教师履行职责情况和