血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)在血管损伤因素刺激下可发生表型转换而获得增殖能力。VSMC增殖是高血压、动脉粥样硬化和血管再狭窄等血管重塑性疾病的共同细胞病理学基础。阐明VSMC增殖的发生机制,对防治血管重塑和逆转增殖性血管病变具有重要的意义。血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)不仅具有调节血管舒缩功能的活性,而且在VSMC增殖中也发挥关键作用,Ang II通过与细胞膜上相应的Ang II受体结合而激活多条信号途径,引发一系列细胞内信号级联反应和相关基因表达,进而调节VSMC表型和功能。研究Ang II调节促增殖基因的表达和促进VSMC增殖的作用机制,有助于阐明血管增殖性疾病发生的分子机制。Krüpple样因子5(krüpple-like factor,IKLF/KLF5)是KLF家族中与胚胎发育、细胞增殖和肿瘤发生密切相关的转录调节因子。我们在前期研究中发现,在血管新生内膜的VSMC中,KLF5的表达明显增加。已有研究显示,Ang II可显著诱导体外培养的VSMC高表达KLF5,后者参与反式激活cyclin D1基因的转录调节。但是,三者在VSMC增殖调节中的相互关系和分子机制尚不清楚。为了阐明KLF5在Ang II调节cyclin D1基因表达及促进VSMC增殖中的作用,本文在系统观察Ang II对VSMC增殖、迁移活性影响的基础上,进一步探讨了KLF5在介导Ang II促增殖中的作用和分子机制。旨在为揭示动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等心血管疾病的发病机制提供新的实验和理论依据,为心血管疾病的防治提供特异性药物靶点。1 Ang II对VSMC增殖和迁移的影响利用MTT、流式细胞术和Western blot分析等方法,观察Ang II对VSMC增殖及迁移活性、细胞周期进程、分化和去分化标志基因表达的影响。结果如下:1.1 Ang II对VSMC生物学行为的影响MTT分析、流式细胞术和伤口愈合实验结果显示,不同浓度(10-8、10-7、10-6 M)的Ang II处理细胞不同时间(3、6、12、24、48 h)后,可明显增加VSMC增殖和迁移活性,而且具有明显的浓度依赖性和时间依赖性。其中,以10-7 M的Ang II处理VSMC 24 h时的效应最强。10-7 M Ang II处理24 h,可引起VSMC形态的改变,从长梭形和纺锤形转变为鹅卵石状,体积增大,胞浆丰满,形态呈现典型的合成表型,并且细胞数目明显增多。1.2 Ang II对VSMC分化标志基因SM22α和增殖标志基因PCNA表达的影响分化标志基因SM22α是分化型VSMC的重要分子标志,而PCNA则是VSMC处于增殖状态的重要标志。采用RT-PCR、Western blot和细胞免疫化学方法,分别从转录水平和翻译水平观察了两种表型标志基因在Ang II诱导VSMC增殖过程中的表达变化。结果显示,在Ang II处理的细胞中,分化标志基因SM22αmRNA和蛋白的表达水平明显降低,而增殖标志基因PCNA表达活性则显著升高,具有明显的时间和浓度依赖效应。结果提示,Ang II是VSMC的促增殖因子。2 KLF5在Ang II诱导的cyclin D1表达及VSMC增殖中的作用众多研究表明,转录因子KLF5是一个与细胞生长、增殖和凋亡调节密切相关的基因,在VSMC增殖及血管病变形成过程中起重要的调控作用。本部分研究观察了Ang II诱导VSMC增殖过程中KLF5和cyclin D1的表达变化及二者之间的关系。2.1 Ang II对体外培养的VSMC cyclin D1和KLF5表达的影响RT-PCR和Western blot结果表明,Ang II可显著诱导KLF5和cyclin D1基因的转录和蛋白表达,并具有明显的时-效(3、6、12、24、48 h)和量-效(10-8、10-7、10-6 M)关系。细胞免疫化学分析显示,在Ang II处理的VSMC中,KLF5阳性染色颗粒明显增多,且主要分布在细胞核内。2.2 KLF5过表达对VSMC cyclin D1表达和VSMC增殖及迁移活性的影响以KLF5腺病毒表达载体Ad-KLF5感染VSMC 48 h,经Western blot分析和细胞免疫化学染色证实,外源性KLF5在VSMC中高效表达。在Ad-KLF5感染的VSMC中,cyclin D1的表达活性也明显升高,与KLF5的变化趋势一致。在KLF5过表达的细胞中,PCNA的表达活性也同步升高,提示细胞处于高增殖活性。MTT分析、流式细胞术检测和伤口愈合实验结果显示, Ad-KLF5感染的VSMC,其细胞增殖活性和迁移活性均明显高于空载体感染的细胞。2.3 KLF5基因敲低对VSMC cyclin D1基因表达和VSMC增殖及迁移活性的影响将KLF5特异性小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)导入VSMC,阻断内源性KLF5的表达,进一步研究KLF5在Ang II诱导VSMC增殖中的作用。结果显示,导入KLF5-siRNA后, KLF5基因和蛋白的表达活性降低约70%以上,表明该基因已被有效敲低。RT-PCR和Western blot结果显示,转染KLF5-siRNA的VSMC,其Ang II诱导的KLF5和细胞周期相关基因cyclin D1的表达水平明显低于转染无关序列NS-siRNA对照组;细胞免疫化学染色结果显示,在转染KLF5-siRNA组的细胞核内,KLF5和PCNA的阳性染色颗粒明显少于转染无关序列NS-siRNA对照组;同时,细胞的增殖活性和迁移活性也随着KLF5的敲低而明显减弱。3 KLF5与c-Jun相互作用介导Ang II诱导的cyclin D1基因表达序列分析显示,在cyclin D1基因启动子区存在KLF5和AP-1结合位点。KLF5与AP-1均可能参与cyclin D1基因的转录激活调节。本部分研究探讨这两种转录因子在cyclin D1基因转录激活过程中的作用及相互关系,进一步揭示Ang II诱导cyclin D1基因表达的调控机制。3.1 KLF5对cyclin D1启动子指导的报告基因表达的影响荧光素酶活性分析结果显示,KLF5可明显促进cyclin D1启动子的转录激活活性,而缺失了N端的激活结构域的KLF5C突变体不能激活cyclin D1启动子报告基因的表达。3.2 Ang II诱导cyclin D1基因表达与促进KLF5与c-Jun相互作用有关ChIP分析结果显示,用KLF5或c-Jun抗体分别沉淀Ang II处理细胞的染色体片段,从中均可以扩增得到cyclin D1基因启动子区的2个KLF5(-868~-1094、-538~-801)和1个AP-1(-10~-245)的结合序列,但在未经Ang II处理的细胞中不能检测出上述DNA序列。表明KLF5和AP-1在反式激活cyclin D1基因转录过程中都发挥调控作用。交互免疫沉淀结果显示,在Ang II刺激的VSMC中,KLF5可被c-Jun抗体沉淀,同样,c-Jun亦可被KLF5抗体所沉淀,并且随着时间的延长二者的结合量逐渐增加,在Ang II作用1 h时达到高峰。该结果表明,在体内,KLF5与c-Jun之间存在物理学上的相互作用,并且Ang II能够诱导二者之间的相互缔合。3.3 KLF5与c-Jun在体外相互作用GST pull-down结果显示,细胞核蛋白中的KLF5可被GST-c-Jun融合蛋白淘选出来。而且,从Ang II刺激的VSMC核蛋白中,用GST-c-Jun亲和得到的KLF5较对照组明显增多。结果表明,Ang II可诱导c-Jun与KLF5在体内、外的相互作用。3.4 AP-1与KLF5协同激活cyclin D1基因表达将cyclin D1启动子报告基因转染COS-7细胞,Ang II处理可诱导报告基因的表达活性;当与c-Jun或KLF5表达质粒共转染时,Ang II诱导的报告基因表达活性有较大的升高;而c-Jun和KLF5表达质粒共转染细胞时,报告基因的激活较单独转染组升高1倍左右。结果表明,AP-1与KLF5在Ang II诱导的cyclin D1基因表达中具有叠加作用。4 Ang II诱导VSMC增殖的信号转导机制Ang II通过与VSMC上的相应受体相互作用而触发细胞增殖信号的跨膜转导,最终引起细胞增殖相关基因表达及VSMC增殖。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应是转导细胞增殖信号进入细胞核的一条重要信号转导通路。本部分探讨了Ang II对VSMCs中MAPK信号途径的影响,以期阐明Ang II诱导KLF5活化和促进细胞增殖的信号调节机制。4.1 Ang II诱导VSMC中KLF5的磷酸化活化用磷酸化丝氨酸抗体和KLF5抗体进行交互沉淀来检测磷酸化KLF5的水平。当Ang II作用VSMC 0.5 h时,磷酸化KLF5的水平开始升高,1 h时达到高峰,具有明显的时-效关系。而在同样条件下,KLF5总蛋白水平并无明显改变。4.2 ERK 1/2和p38MAPK通路介导Ang II诱导的KLF5磷酸化用特异性磷酸化抗体检测MAPK通路中的三个主要成员,即ERK 1/2,JNK,p38MAPK的磷酸化水平变化。结果显示,当Ang II处理VSMC15 min时,ERK 1/2和p38MAPK的磷酸化水平开始升高,到30 min时达到高峰,并维持在此水平至2 h时开始下降。但Ang II处理不影响JNK的磷酸化水平。为了进一步明确ERK 1/2和p38MAPK在Ang II诱导KLF5磷酸化中的作用,分别用ERK 1/2的特异性阻断剂PD98059和p38MAPK的特异性阻断剂SB203580处理细胞。Western blot分析显示,在Ang II刺激VSMC 30 min时,与未用阻断剂组相比,PD98059和SB203580可明显降低KLF5的磷酸化水平,cyclin D1表达活性也平行降低。结果提示,Ang II可通过激活ERK 1/2和p38MAPK信号通路而诱导KLF5磷酸化活化,进而促进cyclin D1表达和VSMC增殖。4.3 ERK 1/2和p38MAPK通路介导Ang II诱导的VSMC增殖和cyclin D1基因表达为了证明Ang II激活ERK 1/2/MAPK和p38/MAPK通路与其促VSMC增殖作用之间的关系,用特异性阻断剂处理细胞后,检测了Ang II诱导的VSMC增殖活性的变化。结果显示,加入阻断剂PD98059和SB203580后,均可降低Ang II的促VSMC增殖效应;细胞周期分析可见,Ang II可使G0/G1期细胞数目明显减少,S期细胞明显增加,细胞周期进程加快;而加入阻断剂PD98059和SB203580后,Ang II诱导的细胞周期变化消失。结果提示,ERK 1/2和p38MAPK参与介导了Ang II促VSMC增殖的信号转导。进一步的报告基因分析显示,用ERK 1/2和p38MAPK通路的特异性阻断剂阻断Ang II信号的胞内转导后,Ang II诱导的cyclin D1启动子-报告基因表达活性显著降低。结果提示,ERK 1/2和p38MAPK通路在Ang II诱导的cyclin D1表达中发挥重要作用。结论1 Ang II诱导VSMC发生表型转化,促进VSMC增殖和迁移。2 Ang II促VSMC增殖效应与上调转录调节因子KLF5和细胞周期调节蛋白cyclin D1基因表达有关。过表达KLF5可上调cyclin D1基因和增殖标志基因PCNA的表达活性。KLF5敲低可消除Ang II诱导的VSMC增殖效应。3 Ang II通过诱导KLF5和c-Jun的相互作用而激活cyclin D1基因表达。4 Ang II诱导KLF5的磷酸化活化和促细胞增殖效应是通过激活ERK 1/2和p38MAPK通路实现的。