背景：肺炎是常见的小儿肺系疾病,在综合性医院儿科住院病例单病种统计中居首位,WHO列为全球3种重要儿科疾病之一。在我国小儿急性下呼吸道感染中,病毒约占1/3,并呈上升趋势,其中以呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus; RSV)最多。RSV肺炎以热证为多见,其中痰热闭肺证是RSV肺炎最为常见和重要的一种证候。一个证候包含了多脏器多指标间的复杂联系,很难用单一指标或某几个指标的简单叠加来阐释证候物质基础。如何科学、全面地阐述中医证候的实质和内涵是现代中医学亟需解决的一个重要问题。国内外研究表明,对于小儿病毒性肺炎的治疗,西药尚缺乏理想药物,唯一被美国儿科协会推荐为“也许可以使用”的药物是利巴韦林。中医药治疗有一定的优势,且已经为大量临床和实验研究所证实。南京中医药大学汪受传教授领衔的本课题组从事中医药治疗小儿病毒性肺炎研究近20年,研制了有效中药方剂金欣口服液,具有宣肺开闭、清热解毒、化痰止咳等功效。课题组前期已经对金欣口服液在RSV感染方面的作用进行了大量研究,然而,由于金欣口服液活性化学成分的复杂性,目前金欣口服液对RSV肺炎的整体代谢网络调控作用仍不清楚。代谢组学(Metabonomics)是关于生物体内源性代谢物种类、数量及其变化规律的一门新兴学科,是系统生物学技术的重要组成部分。由于代谢物是生物体所有基因、蛋白功能活动的终点,因而被视作生物体整体功能状态的“生化表型”,能够即时、灵敏、真实的表现在各种外界因素的刺激下生物体整体功能状态的应答与调节,避免了既往采用单一或少数几个指标来研究某种生理、病理变化的弊端。代谢组学技术在方法学上融整体、动态、综合分析于一体的特点,与中医学的整体观念相一致。因此本课题采用代谢组学方法,结合其他生化检测,全面表征RSV肺炎痰热闭肺证所导致的代谢物组变化,尝试阐明RSV肺炎痰热闭肺证的本质和金欣口服液对RSV感染小鼠的治疗作用。目的：研究RSV肺炎痰热闭肺证患儿血浆和尿液的代谢特征,探讨RSV肺炎痰热闭肺证的证候实质；研究RSV肺炎BALB/c小鼠血浆和肺组织的代谢特征,探讨金欣口服液对RSV肺炎BALB/c小鼠的干预作用及可能的代谢调控机制。方法：RSV肺炎痰热闭肺证代谢组学的临床实验：选择符合中西医诊断条件的RSV肺炎痰热闭肺证患儿30例,设为疾病组,同时设健康正常组30例。分别采集两组儿童的血浆和尿液,采用超高效液相色谱-二维线性离子阱质谱联用仪(Ultra-performance Liquid Chromatography coupled with Linear Ion Trap Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometry, UPLC-LTQ/Orbitrap-MS)检测两组的血浆和尿液的代谢产物,建立小儿RSV肺炎痰热闭肺证的证候相关代谢谱,利用主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)和正交偏最小二乘法(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, OPLS-DA)对检测的矩阵数据进行统计分析,筛选潜在的血浆、尿液生物标记物,分析相关代谢通路,探索RSV肺炎痰热闭肺证的代谢特征本质。金欣口服液干预RSV肺炎BALB/c小鼠的动物实验：RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,金欣口服液进行干预,并设利巴韦林为阳性对照,6天后分别采集小鼠血浆、肺组织,行肺组织病理切片形态学分析来评价肺部病变情况,基于UPLC-LTQ/Orbitrap-MS研究各组小鼠血浆和肺组织整体代谢变化,利用PCA和OPLS-DA分析检测数据,筛选潜在的血浆、肺组织生物标记物,分析相关代谢通路,评价金欣口服液的药效,阐明金欣口服液的代谢调控机制。结果：RSV肺炎痰热闭肺证代谢组学的临床实验：1.血浆代谢组学模式识别分析结果显示,RSV肺炎痰热闭肺证患儿与健康正常组儿童主成分积分值大部分集中分布于散点图的椭圆形(95%置信区)区域内,虽有一定的分离趋势,但仍存在交叉重叠,进一步构建OPLS-DA模型,模型参数分别为R2Y=0.907, Q2=0.567(血浆上层样本)和R2Y=0.816, Q2=0.619 (血浆下层样本),正常组和RSV肺炎痰热闭肺证组沿第一主成份t[1]轴方向能完全分离,无交叉和重叠,说明两组在代谢特征方而具有明显差异：筛选了21个潜在生物标记物,并鉴定了其中的20个；其中SM(18：2/24：0)、SM(d18:2/24:1)、SM(d18:0/18:1)等鞘磷脂,TG(16:0/18:1/22:6)、TG(16:0/18:0/22:6)、 TG(16:0/20:4/22:5)、TG(18:1/18:3/20:4)、TG(16:0/20:3/22:4)等甘油三酯在RSV肺炎痰热闭肺证患儿血浆中呈上调趋势,PC(18:0/18:2)、PC(18:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(18:0/20:3)、 PC(16:0/22:5)、PC(18:2/20:0)、LysoPC(18:2)等磷脂酰胆碱,TG(14:0/16:0/18:2)、TG(14：0/16：0/16：1)等甘油三酯在RSV肺炎痰热闭肺证患儿血浆中呈下调趋势,此外,还发现了Bilirubin、Carnitine、Tryptophan等与RSV肺炎痰热闭肺证有关的物质,较正常儿显著下降。2.尿液代谢组学模式识别分析结果显示,采用PCA方法对RSV肺炎痰热闭肺证患儿与健康正常组儿童样本建模,大部分样本集中分布于散点图的椭圆形(95%置信区)区域内,虽有一定的分离趋势,但仍存在交叉重叠,进一步建立OPLS-DA模型,参数分别为R2Y=0.865, Q2=0.580 (a Q色谱柱所测尿液样本)和R2Y=0.902, Q2=0.593 (HILIC色谱柱所测尿液样本),正常组和RSV肺炎痰热闭肺证组完全分离,说明两组在代谢物方面具有明显差异；筛选了15个差异性生物标记物,并鉴定了其中11个；Acetylcarnitine. 3-Methylglutarylcarnitine、1-Pyrroline-4-hydroxy-2-carboxylate、Kynurenine、Tryptophan、 Acetylspermidine、Cytosine、Tryptamine等在RSV肺炎痰热闭肺证患儿尿液中呈上调趋势,Methyldopa、N-Methylhydantoin等在RSV肺炎痰热闭肺证患儿尿液中呈下调趋势。金欣口服液干预RSV肺炎BALB/c小鼠的动物实验：1.RSV感染BALB/c小鼠后肺组织病理改变主要表现为间质性肺炎,肺泡壁充血增厚,间质有单核巨噬细胞及中性粒细胞浸润,支气管上皮细胞无明显变性、坏死,支气管管腔及肺泡腔无明显渗出物；金欣口服液干预后肺部充血及炎症有不同程度的减轻。病理评分结果显示治疗组较模型组显著下降。2.RSV感染6天后,BALB/c模型小鼠与正常小鼠血浆数据基于OPLS-DA模型能完全分离,模型参数分别为R2Y=0.917,Q2=0.835(血浆上层样本)和R2Y=0.967,Q2=0.936(血浆下层样本),表明造模成功,RSV感染引起了小鼠血浆代谢特征的变化；筛选并鉴定25个生物标记物；其中PC(18:1/22:6).PC(18:0/205)等磷脂酰胆碱和TG(18:1/18:2/18:2)、 TG(18:1/18:1/18:2)等甘油三酯在模型组小鼠血浆中较正常组显著增加,PC(18:1/18:3)、 PC(18:0/22:6)、PC(P-18:1/22:2)、PC(O-18:0/22:6)、PC(O-20:0/22:6). PC(16:0/20:4)、 PC(P-20:0/14:0)、LysoPC(16:0)、LysoPC(18:2)、LysoPC(18:0)、LysoPC(20:4)、LysoPC(18:1)、 LysoPC(22:6)等磷脂酰胆碱,SM(d18:1/24:1).SM(d18:0/18:1).SM(d18:2/24:1)、 Phytosphingosine等鞘脂质和TG(16:0/18:0/14:0).TG(16:0/16:0/18:0)等甘油三酯在模型组小鼠血浆中较正常组显著下‘降,此外,PE(18:3/19:0)、Phytanic acid等也呈下调趋势。基于所筛选出的生物标记物,我们评价了金欣口服液的药效,发现金欣口服液能不同程度的回调其中11个生物标记物,且主要通过调节甘油磷脂的代谢通路而发挥作用。3.RSV感染6天后,基于BALB/c模型小鼠与正常组小鼠肺组织数据构建OPLS-DA模型,两组完全分离,无交叉和重叠,模型参数分别为R2Y=0.879,Q2=0.789(肺组织上层样本)和R2Y=0.918,Q2=0.853(肺组织下层样本),表明造模成功,RSV感染引起了小鼠肺组织代谢网络的变化；筛选并鉴定25个生物标记物；其中PC(18:0/18:1)、 PC(18:0/18:2)、PC(22:6/18:2)、PC(18:2/20:4)、PC(P-20:0/14:0)、LysoPC(18:0)、LysoPC(16:0)、 LysoPC(18:1)、LysoPC(20:4)、LysoPC(18:2)等磷脂酰胆碱,SM(40:1)、SM(d18:1/20:0)、 Sphinganine、Phytosphingosine等鞘脂质和TG(18：1/18：1/18：1)、TG(18:1/16:0/20:1)、 TG(18:1/18:1/18:2)、TG(18:1/18:2/18:2)、TG(16:0/18:0/22:6)、TG(18:1/18:0/20:1)等甘油三酯在RSV肺炎BALB/c小鼠中含量较正常组显著下降,此外,Phytanic acid、Leucine、 Phenylalanine、Choline、LysoPE(16:0)等亦与RSV感染有关,在模型组小鼠中呈下调趋势。基于所筛选出的生物标记物评价金欣口服液的抗病毒药效,结果发现金欣口服液能不同程度的回调肺组织中16个生物标记物,主要通过调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、甘油磷脂代谢、鞘脂质代谢通路而发挥作用。结论：1. UPLC-LTQ/Orbitrap-MS分析代谢组学能够初步阐释并区分RSV肺炎痰热闭肺证与健康正常儿二者不同的代谢模式。2.RSV肺炎痰热闭肺证患儿血浆和尿液中主要以色氨酸、甘油磷脂代谢紊乱为标志。3.RSV肺炎BALB/c小鼠血浆和肺组织主要表现为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、甘油磷脂代谢、鞘磷脂代谢发生紊乱。4.金欣口服液能够明显减轻RSV感染小鼠的肺部炎症。5.金欣口服液能够部分调整RSV感染引起的代谢紊乱,主要通过调节苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、甘油磷脂代谢、鞘脂质代谢通路而发挥作用。