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目的研究Cyr61在ALL(Acute Lymphoblastic Leukemia,急性淋巴细胞白血病)中的表达情况,并探讨其对Ara-C(Cytosine arabinoside,阿糖胞苷)化疗敏感性的影响及作用机制,为寻找ALL新的治疗靶点奠定理论基础和实验依据。方法1 Cyr61在ALL患者中的表达情况(1)收集尚未进行任何放、化疗的初诊ALL患者以及正常对照者骨髓液和外周血标本,并用ELISA法检测Cyr61蛋白表达含量。(2)提取ALL患者和正常对照者的骨髓单个核细胞,Western blot法检测细胞中Cyr61蛋白表达含量。(3)收集对数生长期的ALL细胞系(Jurkat细胞和Nalm-6细胞),提取细胞总蛋白,Western blot法检测Cyr61蛋白表达含量。2 Cyr61对Ara-C诱导ALL细胞凋亡的影响(1)收集对数生长期的ALL细胞系(Jurkat细胞和Nalm-6细胞),加入一系列不同浓度的重组人Cyr61蛋白,预先作用24h后,加入Ara-C(1μM)继续培养24h,Annexin V-FITC/PI检测细胞的凋亡情况(2)脂质体法介导质粒PEGFP-Cyr61和PEGFP-N3转染Jurkat细胞和Nalm-6细胞,获得高表Cyr61的ALL-Cyr61细胞株(Jurkat-Cyr61和Nalm-6-Cyr61细胞)和对照ALL-N3细胞株(Jurkat-N3和Nalm-6-N3细胞),后分别加入Ara-C(1μM)作用24h,收集细胞,Annexin V-PE流式细胞术检测细胞凋亡情况。(3)接下来,我们收集高表达Cyr61(185 pg/ml)的ALL患者骨髓上清液,作为ALL细胞(Jurkat和Nalm-6细胞)的培养背景,应用Annexin V-FITC/PI双染法检测骨髓源性的Cyr61对Ara-C诱导ALL细胞凋亡的影响。3 Cyr61诱导ALL细胞化疗不敏感相关机制的研究(1)应用Real-time PCR和Western blot分别检测Cyr61对Nalm-6和Jurkat细胞中的凋亡相关分子Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad的mRNA和蛋白的表达影响。(2)ALL细胞培养体系加入Cyr61的同时,分别加入PDTC(NF-κB特异性抑制剂)或PD98059(ERK1/2特异性抑制剂),预先作用24h,后加入Ara-C继续作用24h,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞的凋亡作用;应用Western blot的方法检测Cyr61对Nalm-6和Jurkat细胞中NF-κB、p-NF-κB、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达及其磷酸化水平的影响。(3)ALL细胞培养体系同时加入Cyr61和PDTC(NF-κB特异性抑制剂),作用24h后,用Western blot的方法检测细胞中Bcl-2蛋白的表达情况。结果1 Cyr61在ALL患者中表达明显增高(1)与正常对照者相比,Cyr61在ALL患者骨髓和外周血中表达增高;进一步分析显示,ALL患者骨髓中Cyr61蛋白表达含量与骨髓原始细胞数正相关,且外周血中Cyr61蛋白表达含量与白细胞数正相关。(2)通过Western blot法检测发现,Cyr61在ALL细胞系(Jurkat、Nalm-6细胞)和ALL患者骨髓单个核细胞中均有表达,进一步分析显示,与正常对照组相比,Cyr61蛋白在ALL患者骨髓单个核细胞表达明显增高。2 Cyr61能够降低Ara-C诱导ALL细胞的凋亡(1)外源性重组人Cyr61能够明显降低Ara-C对Jurkat和Nalm-6细胞的凋亡作用,且呈剂量依赖性;抗Cyr61单克隆抗体(093G9)可以显著拮抗Cyr61这一效应。(2)在成功构建高表达Cyr61的ALL-Cyr61细胞株(Jurkat-Cyr61、Nalm-6-Cyr61细胞)和对照细胞ALL-N3细胞株(Jurkat-N3、Nalm-6-N3细胞)的基础上,通过流式检测发现,与对照细胞ALL-N3细胞株相比,高表达Cyr61的ALL-Cyr61细胞株对Ara-C诱导的凋亡明显降低。(3)ALL患者骨髓液中高浓度的Cyr61能够降低Ara-C诱导ALL细胞的凋亡,而093G9阻断骨髓中Cyr61的生物活性后,则显著提高Ara-C对ALL细胞的凋亡。3 Cyr61通过NF-κB/Bcl-2通路降低Ara-C诱导ALL细胞的凋亡(1)Cyr61能够促进Jurkat和Nalm-6细胞中抗凋亡分子Bcl-2在mRNA和蛋白的表达,而对其他凋亡调控分子包括Bcl-xl、Bax和Bad表达均无明显作用。(2)流式结果显示,PDTC(NF-κB特异性抑制剂)能够显著抑制Cyr61的抗凋亡作用,提高ALL细胞对Ara-C敏感性;Western blot检测显示,Cyr61作用Jurkat和Nalm-6细胞10 min后,显著提高细胞中NF-κB磷酸化水平。(3)Western blot结果显示,PDTC能够阻断Cyr61对抗凋亡分子Bcl-2蛋白调控作用,显著降低ALL细胞中Bcl-2蛋白含量。结论1 Cyr61在ALL患者的骨髓和外周血中高表达。2 Cyr61通过NF-κB/Bcl-2信号通路降低ALL细胞对Ara-C化疗的敏感性,提示Cyr61是骨髓微环境参与急性淋巴白血病的发病调控因素之一,为将来寻找ALL新的治疗靶点提供了重要的实验依据。