酵母鲁棒性即为酵母在受到环境胁迫时仍能保持其生理功能稳定。在工业发酵过程中,提高发酵菌种的鲁棒性尤其是耐热性能大幅降低能耗、提高产物产率,最终降低发酵成本。本论文从酿酒酵母细胞鲁棒性与细胞内蛋白质关系入手,着眼于增强酿酒酵母中蛋白质内平衡网络(Proteostasis Network,PN)功能进而调控蛋白质内平衡,通过分别调节PN体系内的一些关键因子如泛素蛋白酶体、泛素酶E2和泛素酶E3等得到新的工程菌提高酿酒酵母鲁棒性和细胞活性。在转录水平和蛋白质水平进行了相应机理的探究,开辟了一个提高酿酒酵母鲁棒性的新思路。主要研究结果如下:首先构建了针对泛素蛋白酶体pre9的α3亚基N末端改造的一系列工程菌株,包括1)α3亚基N末端缺失突变株工程菌S.c-P△-G,2)在基因组上过表达α3亚基N末端缺失突变体工程菌S.c-FP△-G,3)以质粒形式过表达完整α3亚基和4)α3亚基N末端缺失突变体的酿酒酵母工程菌S.c-Pre9-P和S.c-P△-P。其次构建了能同时过表达泛素酶E2和E3的双功能元器件及对应酿酒酵母工程菌S.c-U+R。采用三种高温发酵模式(恒温40℃、恒温42℃和梯度升温(37℃-43℃))考察上述5株酿酒酵母工程菌在热胁迫下的鲁棒性。40℃恒温培养84 h后,工程菌S.c-P△-P的菌体OD值分别比对照菌株WT/V(含空质粒的菌株)、S.cPre9-P、S.c-U+R、S.c-P△-G、S.c-FP△-G及无抗生素压力的出发菌株WT提高了120.0%、220.8%、6.01%、93.7%、33.9%及35.7%;证实了缺失突变株工程菌S.c-P△-P优越的耐热性。不过在42℃恒温培养时,除菌株S.c-P△-P的菌体量在24h获得明显增长外,其它菌株始终受到生长抑制。然而在梯度升温发酵时,缺失突变株工程菌S.c-P△-P仍表现出最佳生长优势。除了良好的耐热性,TTC实验及MDH酶活测定结果表明缺失突变株工程菌S.c-P△-P还具有最高的细胞活力。胁迫点滴平板结果显示,与WT/V相比,缺失突变株工程菌S.c-P△-P以及双功能工程菌S.c-U+R(同时过表达泛素酶E2和E3)的抗DNA损伤胁迫、抗渗透压胁迫、抗氧化胁迫、抗热激胁迫、抗细胞壁损伤胁迫、抗乙醇胁迫等多个方面的抗胁迫能力均有明显提高;与出发菌株WT相比,工程菌S.c-FP△-G及S.c-P△-G的抗氧化胁迫、抗热激胁迫、抗细胞壁损伤胁迫的能力也大大增强。通过比较各菌株的几丁质合酶的转录水平还发现:改造蛋白酶体(截除α3亚基N末端)可以明显提高细胞内几丁质合酶的转录水平,进而提高细胞的抗热激,抗细胞壁损伤胁迫能力;且硫黄素T染色实验结果表明对泛素蛋白酶体的改造或是同时过表达泛素酶E2和E3都可使细胞表现出更强的降解聚集蛋白质的能力进而使酵母细胞迅速恢复细胞活力。以上结果都表明通过调节蛋白质内平衡网络PN内的关键因子泛素蛋白酶体、泛素酶E2和泛素酶E3等可以从多方面有效地提高酿酒酵母鲁棒性和细胞活性。在工业转化应用方面,转化至工业发酵菌株-安琪酵母中表征双功能元器件R+U结果显示同时过表达泛素酶E2和E3可以提高细胞活性、耐热性,提高细胞酒精产量;Western Blot实验证明细胞泛素化的水平也随之升高。结果表明通过调控蛋白质内平衡网络PN增强酵母细胞鲁棒性具有良好的普适性、功能稳定性及工业应用潜能。