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目的:菲骈吲哚里西啶活性生物碱(13a R,14R)-9,11,12,13,13a,14-六氢-3,6,7-三甲氧基二苯并[f,h]吡咯并[1,2-b]异喹啉-14-ol(HTBPI)来源于传统中草药卵叶娃儿藤(Tylophora ovata(Lindl.)Hook.ex Steud.)。HTBPI具有良好的抗肿瘤生物活性,但其抗肿瘤机制研究尚不明确。本课题旨在对HTBPI抗肝细胞癌(HCC)作用进行研究,探究其具体作用机制,为HTBPI的临床应用提供理论依据。方法:(1)采用细胞计数试剂盒8(Cell counting kit-8,CCK8)和平板克隆形成实验检测HTBPI对HCC细胞活力及增殖能力的影响;(2)4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色、免疫印迹分析(Western blot)和流式细胞术检测HTBPI对HCC细胞凋亡的影响;(3)Western blot、透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)和免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)检测HTBPI对HCC细胞自噬的影响;(4)使用自噬抑制剂巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1,BA1)抑制自噬,通过Western blot和流式细胞术检测HTBPI对HCC细胞凋亡的影响;(5)应用细胞热转变分析实验(Cell thermal transformation analysis,CETSA)和药物亲和力反应靶标稳定性测定(Drug affinity response target stability,DARTS)实验分析HTBPI与蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)之间的结合关系,采用分子对接模拟HTBPI与Akt的结合模式,分析作用位点,利用Western blot实验对其进行验证;(6)通过转染Akt质粒的方式,过表达两种HCC细胞Hep G2和Hep3B的Akt,采用Western blot和IF实验分析HTBPI对HCC细胞的凋亡和自噬的影响;(7)建立患者来源的异种移植(PDX)肝癌小鼠模型,采用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)及免疫组化(immunohistochemistry,IHC)实验检测HTBPI对小鼠脏器产生的病理影响及对细胞凋亡和自噬相关蛋白的影响;(8)TCGA数据库进一步评估Akt磷酸化水平与肿瘤患者生存期之间的关系。结果:(1)CCK8和平板克隆形成实验结果显示,HTBPI显著抑制HCC细胞生存活力,降低单细胞克隆能力;(2)Western blot实验结果表明HTBPI可显著调节凋亡相关蛋白聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(Poly-ADP-ribose polymerase,PARP)、裂解半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase3)、促凋亡相关因子(B-Cell CLL/Lymphoma 2,Bcl-2)和抑凋亡相关因子(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)表达水平,经DAPI染色后,核小体发生明显的破碎,使用流式细胞仪检测HTBPI可诱导HCC细胞凋亡;(3)HTBPI显著改变自噬相关蛋白泛素蛋白(Sequestosome1,p62)与微管相关蛋白1轻链3(Microtubule Associated Protein 1 Light Chain 3,LC-3)的表达水平,p62荧光强度和自噬溶酶体的数量;(4)BA1抑制自噬后,经HTBPI处理,HCC细胞活力与增殖进一步降低,Western blot实验结果和凋亡试剂盒检测结果表明细胞凋亡显著增加;(5)HTBPI可减缓链金霉素或温度对Akt的降解速度,HTBPI可以直接与Akt的C-末端结构域结合,并可以显著抑制苏氨酸308(Thr308,T308)的磷酸化;(6)过表达Akt后,HTBPI抑制的细胞活力有一定程度的逆转,凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白也均有一定程度的逆转;(7)经过隔天给药一次,连续21天后,PDX肝癌小鼠中的肿瘤体积较空白组有明显的缩小,且心、肝、脾、肺、肾的HE染色均未发现异常;(8)肿瘤患者的存活期与Akt(T308)磷酸化高表达呈负相关。结论:HTBPI可以诱导HCC细胞发生凋亡和自噬;抑制自噬后,HTBPI诱导的HCC细胞凋亡显著增强;在体内外HTBPI结合抑制Akt(T308)的磷酸化,诱导细胞凋亡和自噬;临床数据分析显示,肿瘤患者的存活期与p-Akt(T308)高表达呈负相关。