背景:胰腺癌是恶性程度最高的人类肿瘤之一,被称之为“癌中之王”。由于胰腺癌早期诊断困难,现有的治疗手段有限,就目前而言,胰腺癌患者的预后依旧很差。临床上近90%的胰腺癌病理类型为胰腺导管腺癌,因此,寻找具有临床意义的肿瘤生物学标记物来预测胰腺导管腺癌的发生、发展以及设计、研发针对肿瘤标记物的靶向药物,对于改善胰腺导管腺癌患者的预后就显得非常迫切和必要。目的:1.探讨Asporin、CD44在胰腺导管腺癌组织中的表达、定位及其临床意义2.探讨Asporin/CD44生物轴对胰腺癌侵袭和迁移生物学行为的影响及机制方法:第一部分:Asporin、CD44在胰腺导管腺癌组织中的表达、定位及其临床意义收集132例胰腺导管腺癌和50例癌旁石蜡组织标本、临床、病理和预后资料,采用IHC和免疫荧光分别评估Asporin和CD44在胰腺导管腺癌组织和癌旁组织中的表达和定位,SPSS16.0统计软件对结果进行分析。第二部分:体外实验Asporin/CD44生物轴对胰腺导管腺癌侵袭和迁移生物学行为的影响及机制1.Asporin在人活化和去活化PSCs中的表达和定位:通过outgrowth法、油红染色法和α-SMA免疫荧光染色法,分离、鉴定并获得人源性PSCs后,使用ARTA诱导PSCs去活化,通过基因芯片、RNA测序、RT-PCR、Western Blot、细胞免疫荧光染色检测Asporin在活化和去活化PSCs中的表达和定位。2.旁分泌Asporin对胰腺癌细胞系(Mia PaCa-2和PANC-1)侵袭、迁移能力的影响:siRNA敲低PSCs中的Asporin,观察Asporin敲低前后,PSCs上清对胰腺癌细胞系侵袭和迁移能力的影响。3.Asporin 和 CD44 在胰腺癌细胞系(AsPc-1,BxPC-3,Mia PaCa-2 和 PANC-1)中的表达及两者之间相互作用的验证:RT-PCR、Western Blot、细胞免疫荧光染色检测Asporin和CD44在胰腺癌细胞系中的表达,并利用CO-IP验证两者之间的相互作用。4.旁分泌Asporin影响胰腺癌侵袭和迁移生物学行为的机制:1)使用rhAsporin、CD44中和抗体或NF-KB转录因子抑制剂处理Mia PaCa-2和PANC-1后,检测其侵袭、迁移能力、NF-KB转录活性、EMT相关蛋白及下游信号通路AKT和ERK的变化;2)使用rhAsporin、CD44中和抗体、AKT抑制剂或ERK抑制剂处理Mia PaCa-2和PANC-1后,检测NF-KB转录活性的变化。5.自分泌Asporin对胰腺癌侵袭、迁移能力的影响极其机制:使用siRNA敲低Mia PaCa-2和PANC-1细胞中的Asporin后,观察Asporin敲低前后,两株细胞系侵袭、迁移能力、EMT相关蛋白、TIMP/MMP家族蛋白、AKT、ERK信号通路及NF-K B转录因子的变化。第三部分:体内实验Asporin对胰腺癌侵袭和迁移生物学行为的影响使用慢病毒转染获得的Asporin低表达胰腺癌细胞株和对照细胞株,构建胰腺癌裸鼠原位肿瘤模型,观察两种细胞株在裸鼠胰腺内的侵袭和迁移情况。结果:第一部分:Asporin、CD44在胰腺导管腺癌组织中的表达、定位及其临床意义Asporin主要在胰腺癌肿瘤上皮邻近的间质细胞胞浆中表达,阳性率为81.06%(107/132),也可在部分胰腺癌肿瘤上皮的胞浆中表达,阳性表达率为24.2%(32/132),在正常胰腺组织导管上皮和间质细胞中不表达或弱阳性表达。CD44主要在胰腺肿瘤上皮细胞的胞膜上高表达,阳性率为31.06%(41/132),也可在一小部分胰腺癌的间质细胞中高表达,在正常胰腺的间质和导管上皮中,呈弱表达或不表达。单因素和多因素分析提示:Asporin在肿瘤间质细胞中阳性表达预示患者预后不良(P=0.012),而肿瘤细胞中阳性表达虽和分化之间存在相关性(P<0.000),但与患者的预后无明显相关性(P=0.772);CD44阳性表达与患者的预后相关(P=0.004)。第二部分:体外实验Asporin/CD44生物轴对胰腺癌侵袭和迁移生物学行为的影响及机制1.Asporin在活化PSCs中的表达明显高于去活化PSCs;2.活化PSCs上清对胰腺癌细胞侵袭和迁移的诱导作用,在Asporin敲低后明显减弱;3.Asporin和CD44之间存在物理上的相互作用;4.Asporin/CD44生物轴可通过激活AKT和ERK信号通路来促进Mia PaCa-2和PANC-1细胞内NF-κB的核蓄积,NF-κB的核蓄积进一步通过诱导EMT的发生来促进Mia PaCa-2和PANC-1细胞的侵袭和迁移;5.Asporin敲低后,Mia PaCa-2和PANC-1细胞的侵袭和迁移能力明显降低,且可部分逆转其EMT的生物学过程,同时AKT、ERK信号通路的活化以及其下游转录因子NF-κB的核蓄积明显受到抑制,而Asporin敲低后对胰腺癌细胞TIMP/MMP家族蛋白的表达无明显影响。第三部分:体内实验Asporin对胰腺癌侵袭和迁移生物学行为的影响获得稳定低表达Asporin的PANC-1-Asporin-knockdown细胞株和对照株PANC-1-NC后,通过成功构建裸鼠胰腺癌原位动物模型,连续观察两个月后处死,我们发现:虽然两组均未观察到局部器官的浸润和远处转移,但敲低组肿瘤细胞的恶性程度明显低于对照组。具体表现为:低倍镜下Asporin敲低组和对照组肿瘤平均直径分别是3.7mm和4.4mm,同时Asporin敲低组的肿瘤团块和周围正常的胰腺实质有着明显的界限,而对照组肿瘤团块呈弥散性浸润周围的胰腺实质;高倍镜下Asporin敲低组中的核分裂像明显少于对照组。结论:1.PSCs对PCCs侵袭、迁移及EMT的诱导作用部分是由Asporin/CD44生物轴参与。2.AKT、ERK信号通路及其下游转录因子NF-κB参与了旁分泌Asporin/CD44生物轴对PCCs侵袭、迁移及EMT生物学过程的调控。3.在PCCs中,Asporin/CD44也可以通过自分泌的方式发挥其生物学功能。4.Asporin在PSCs-PCCs相互作用的过程中发挥着重要的作用,有可能成为PDAC靶向治疗的新靶点和新的预后指标。