背景原发性肝癌是我国是最常见的恶性肿瘤之一,每年约有11万例患者死于肝癌。转移是导致肝癌病人死亡最重要的原因,但其确切的机制仍不清楚。大量研究表明microRNAs(mi RNA)在肿瘤转移的分子调控中起着非常重要的作用。miRNA是一类长度约为21-23nt的非编码单链小分子RNA。它首先从内含子中被RNA聚合酶II转录,在细胞核中生成了pri-miRNA,然后运送到胞浆加工成为成熟的miRNA.成熟的miRNA能够被运载到RISC沉默复合体上,和RISC沉默复合体一起,miRNA能够序列特异性的识别靶基因mRNA 3’非翻译区(UTRs),通过降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA翻译沉默基因的表达。大量研究表明,mi RNA在许多肿瘤中表达失调,包括肝癌,它在肿瘤中扮演着癌基因或者抑癌基因,参与了许多的生物学过程,比如:增殖,分化,凋亡和应激反应等。在肿瘤的发生、发展中起着非常重要的作用。已有研究表明miR-149在多种肿瘤中表达失调,而且主要作为抑癌基因参与了肿瘤的发生发展。例如在乳腺癌,结肠癌,胃癌,头颈部癌及非小细胞肺癌中表达较低。Chan等证明在乳腺癌中,miR149能通过靶向GIT1抑制整合素信号抑制乳腺癌的表达;Wang等发现在结肠癌中,因DNA发生甲基化而低表达的miR-149能SP1促进了结肠癌细胞的侵袭和转移,并且低表达的miR-149与结肠癌的不良预后相关。同时我们查阅文献发现miR-149在肝癌中的作用及机制还未见报道,于是课题组前期调查了miR-149在肝癌组织中的表达,发现在肝癌中能抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。但是机制不清楚,本研究拟在前期研究的基础上,进一步阐明miR-149在肝癌中的作用及可能的分子机制。为基于miRNA的肝癌靶向治疗提供理论依据。目的:本课题的目的是为了调查miR-149在肝癌中的作用和机制。材料与方法:(1)实时定量PCR被用于检测mi R-149在肝癌及癌旁肝组织的表达,肝癌组织中mi R-149的实时定量PCR相对值被用于分析临床病理资料和生存曲线。(2)采用带有基质胶的Transwell实验检测感染mi R-149过表达或对照慢病毒肝癌细胞的侵袭能力。(3)采用划痕实验调查miR-149对于肝癌细胞的迁移能力的影响。(4)采用MTT和流式细胞周期实验检测miR-149对肝癌细胞增殖和细胞周期的影响。(5)通过生物信息学分析miR-149潜在的靶基因。(6)通过Western blot筛选miR-149潜在的靶基因。(7)采用双荧光素酶实验调查miR-149和它潜在靶基因的调控关系和结合位点。RT-PCR调查miR-149是否影响靶基因的mRNA水平。(8)通过免疫组化染色(IHC)比较93对肝癌和相对应的癌旁肝组织中靶基因PPM1F的蛋白水平。免疫组化的评分用于分析miR-149和靶基因PPM1F的相关性。(9)荧光原位杂交技术用于检测肝癌和相对应的癌旁肝组织中miR-149的定位和表达水平。(10)通过带有基质胶的Transwell实验和划痕分别检测过表达miR-149并回复靶基因PPM1F的肝癌细胞的穿膜能力和迁移能力。(11)文献报道PPM1F能够在乳腺癌中调节应力纤维的表达。通过免疫荧光染色应力纤维调查mi R-149是否通过调节PPM1F在肝癌中影响应力纤维的表达。(12)文献报道PPM1F在乳腺癌中能抑制MLC2磷酸化,而磷酸化MLC2是纤维组成应力的关键环节,于是我们采用Western blot检测miR-149是否影响了MLC2的磷酸化水平。采用免疫荧光检测pMLC2和应力纤维的共定位。(13)构建裸鼠肝癌肺转移模型用于体内研究miR-149在肝癌中的作用。结果:(1)实时定量PCR显示miR-149在95例肝癌组织中的表达低于癌旁肝组织。临床病理分析结果显示,miR-149在结节性肝癌(nodular HCC)中的表达低于大肝癌(solitary large HCC)和小肝癌(small HCC)。同时,基于肝癌TNM分期的临床病理分析结果显示,三期和四期的肝癌组织中miR-149的表达普遍低于一期和二期的肝癌组织。生存分析的结果显示,当用中位数作为分界线,高表达miR-149组的肝癌患者生存时间优于低表达组(p=0.0229)。(2)带有基质胶的Transwell实验显示miR-149能降低肝癌细胞侵袭能力。(3)划痕实验结果显示miR-149能抑制肝癌细胞的迁移能力。(4)MTT实验和流式细胞周期实验显示miR-149对肝癌细胞的增殖和细胞周期没有影响。(5)生物信息学分析了miR-149可能结合的靶基因,分别从三个生物信息学网站(Targetscan,PicTar,miRanda)进行预测,我们整理并选择了67个共同的基因,最终我们挑选了6个被报道与转移相关的靶基因(YWHAZ,RAP1,CD47,YWHAZ,RAP1,CD47)进行下一步的鉴定。(6)Western blot结果显示在MHCC-97H及HepG2细胞中,过表达miR-149能下调的PPM1F,SP1和PDGFRA的表达。而YWHAZ,RAP1,CD47则变化不明显。(7)双荧光素酶实验显示miR-149能够与PPM1F的3’非翻译区结合,但是不能与SP1和PDGFRA的3’非翻译区结合。点突变能与miR-149保守种子区域结合的PPM1F3’UTR,荧光素酶的活性不再受到miR-149的影响,通过以上实验确定了miR-149的靶基因PPM1F。RT-PCR结果表明miR-149能降低PPM1F mRNA的水平。(8)IHC在肝癌组织中染色PPM1F结果显示,PPM1F在肝癌组织中通常高表达,而且PPM1F(免疫组化半定量评分值)与miR-149(RT-PCR相对值)的相关分析结果显示PPM1F在肝癌组织中与miR-149中呈负相关。(9)荧光原位杂交结果与实时定量PCR的结果一致,均显示miR-149在肝癌中表达低于与其相对应的癌旁肝组织。(10)带有基质胶的Transwell和划痕回复实验显示miR-149对肝癌细胞侵袭和迁移能力的抑制能被重新转入PPM1F后所部分恢复。(11)免疫荧光结果显示在MHCC-97H和HepG2细胞中,mi R-149可使部分肝癌细胞应力纤维丢失,肌动蛋白微丝重组并且重新定位到细胞的边缘。(12)在miR-149过表达的MHCC-97H细胞中重新导入PPM1F后采用免疫荧光检测应力纤维的表达发现应力纤维的丢失能得到部分恢复。免疫荧光检测pMLC2显示mi R-149过表达的MHCC-97H细胞荧光强度较对照组弱,同时pMLC2和应力纤维共定位显示在肝癌细胞MHCC-97H过表达miR-149后pMLC2和应力纤维共定位水平较低。Western blot显示了与免疫荧光一致的结果,过表达miR-149能抑制PPM1F及pMLC2的蛋白水平。(13)体内裸鼠肝癌肺转移实验证明尾静脉注射miR-149过表达的HepG2细胞组肺癌结节的数量和大小明显比对照组低。结论:miR-149在肝癌组织中表达普遍较低,且与肿瘤的TNM分期,肿瘤大体分型和患者的不良预后相关。我们的数据表明,miR-149能够抑制肝癌细胞的侵袭转移,机制是通过直接靶向并且抑制肌动蛋白调节蛋白PPM1F的表达,进而抑制了肌球蛋白轻链2(MLC2)在Thr18和Ser19的磷酸化,而MLC2磷酸化是应力纤维形成的关键环节,最终通过调节应力纤维的形成抑制了肝癌细胞的侵袭和转移。我们最新鉴定的mi R-149/PPM1F轴为肝癌的发病机制提供了新的认识,也为肝癌的治疗提供了新的潜在靶点。