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桑叶是桑科植物桑(Morus alba L.)的叶片,在四川、浙江、江苏、山东等地已广泛种植,是蚕桑经济中的重要植物。作为传统中药之一,桑叶具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效,现代药理学研究表明,桑叶能够降血压、抑菌、抗炎、抗衰老、抗疲劳等。UV-B是紫外线中的一类高能粒子,UV-B辐射对植物的生长和发育具有很强的破坏作用。实验室前期研究表明,UV-B照射15分钟后再进行黑暗培养36小时(UV+D)桑叶的亚细胞结构受到破坏、化合物含量变化、蛋白质组学研究发现与“protein”、“stress”功能相关的蛋白丰度变化。内质网是一个连续的膜系统,参与细胞内蛋白质的合成、修饰、加工、运输等过程,是蛋白质的质量控制中心,内质网的逆境响应机制能够缓解不利环境条件对植物造成的损害。但是目前关于植物内质网分离纯化的相关报道较少,为了能够对桑叶内质网进行蛋白质组学分析以阐释桑叶响应UV+D胁迫的机制,本文对桑叶内质网的分离纯化方法进行探究和优化,在此基础上,对UV+D处理前后的桑叶内质网进行蛋白质组学分析。本文的主要研究内容及结果如下:(1)桑叶内质网的分离纯化方法探究。分别考察了蔗糖密度梯度离心法、差速离心结合氯化钙沉淀法和差速离心(含超速)法三种方法提取桑叶内质网的效果。Western blot和酶促反应的分析结果显示:蔗糖密度梯度离心法不能有效将内质网和细胞核进行分离;差速离心结合氯化钙沉淀法不能有效地富集到桑叶内质网;而差速离心(含超速)法能够较好的富集桑叶内质网,同时在一定程度上去除细胞核、叶绿体、线粒体、细胞质的污染。进一步优化差速离心(含超速)法的实验细节,结果表明使用新鲜叶片而不是冷冻叶片,能够较好的避免细胞核的污染;采用鲜样直接研磨,而不是液氮研磨,能够保证提取效率;在12000xg离心时,使用水平转子而不是定角转子,能够避免大量叶绿体的污染。(2)UV+D诱导桑叶的内质网差异蛋白质组学研究。实验采用了基于TMT标记的gel free蛋白质组学技术,一共鉴定到3948个可定量蛋白。利用三种亚细胞定位预测软件,从中鉴定出297个内质网蛋白,UV+D处理前后具有显著性差异的内质网蛋白有200个(p<0.05)。生物信息学分析结果显示,UV+D胁迫后,P450酶家族蛋白显著富集、PDI家族蛋白显著减少、与过氧化物酶体生物发生相关的蛋白peroxisome membrane protein 11C的丰度显著增加;N-glycan生物合成途径上的UGGT蛋白减少、CNX/CRT循环减弱,α-甘露糖苷酶减少;热休克蛋白如HSP70、HSP90、HSP40以及蛋白质靶向相关蛋白BAP31、蛋白输出相关蛋白SEC63均增加;核糖体蛋白中53个蛋白增加、31个蛋白减少,核膜相关蛋白、EF1-β1和EF1-δ显著增加。说明桑叶可能通过激活氧化还原系统和内质网的蛋白质质量控制系统、增强蛋白质合成功能、减弱蛋白质N端糖基化,以抵御UV+D胁迫。本论文对桑叶内质网提取纯化方法的探究和优化,是对植物叶片内质网纯化方法的首次尝试,为后续研究排除了大量其他亚细胞结构的干扰,同时为其他植物的内质网纯化提供了参考;在此基础上进行了 UV+D诱导前后桑叶内质网的差异蛋白质组学分析,进一步阐释了桑叶响应UV+D胁迫的作用机制,为亚细胞层面探究作用机制奠定了基础,也为其他植物的抗性机制探究提供了新的思路。