研究背景吸烟成瘾是全球关注的一个严重问题。全世界约有1/3的成人吸烟,其导致的被动吸烟公害不容忽视。世界卫生组织(WHO)把每周有1天暴露于环境烟草烟雾(Environmental Tobacco Smoke,ETS)达15min以上定为被动吸烟,被动吸烟在全世界基本上不可避免。ETS又称二手烟,是从烟草制品及吸烟者呼出来的烟雾中飘散出来的一种复杂的混合物,含有尼古丁(Nicotine,Nic)、烟焦油(Smoke tar oil,STO)等4000多种物质。近年来,流行病学调查发现,青少年被动吸烟与吸烟率呈正相关。烟草中的成瘾性物质作为一种惯用的依赖性物质,不仅给依赖者带来很多身体和心理的危害,还预示着将来对其他依赖性物质的滥用,常被称为吸毒的入门药。本实验室前期研究发现低剂量甲苯可以通过嗅觉吸入途径成瘾,丁香酚通过嗅觉通路给药可以提高学习记忆能力。目前对烟草的成瘾性和毒性的作用途径和机制还不是很明确,本研究模拟人们长期处于亚慢性ETS暴露环境中对青少年小鼠进行吸入染毒,研究被动吸烟通过嗅觉通路是否成瘾及长期吸入ETS及其主要成分物质对小鼠神经行为及体重与免疫力的影响,并探讨嗅觉通路在吸烟成瘾中的作用及其可能机制。研究目的:1.亚慢性吸入给药建立小鼠ETS、Nic、STO慢性暴露模型,研究ETS、Nic、STO暴露与吸烟成瘾的关系。2.建立嗅上皮毁损模型,探讨嗅觉通路在成瘾中的作用。3.ETS、Nic、STO亚慢性吸入对小鼠神经行为学的影响。4.研究ETS、Nic、STO对小鼠体重、脾脏指数、胸腺指数及外周血清中补体、免疫球蛋白水平的影响。5.研究成瘾相关脑区的嗅觉事件相关电位和神经递质变化,探讨ETS、Nic暴露作用机制。研究方法:1.ETS染毒实验阶段,通过给药剂量评估实验选择小鼠给药剂量及给药方式。对小鼠进行筛选并随机分组:空白组、被动吸烟组、嗅上皮毁损+被动吸烟组;染毒实验台内小鼠ETS暴露染毒(亚慢性染毒时间一般1~3个月),染毒4w和8w时通过条件性位置偏爱实验(Conditioned Place Preference,CPP)、观察小鼠活动特征等检测小鼠成瘾性,通过自主活动实验、洞板探洞实验、Morris水迷宫实验等行为学方法测定ETS、对小鼠中枢神经兴奋性及空间学习记忆等的影响。2.Nic、STO染毒阶段把小鼠随机分为:空白组、Nic吸入组、嗅上皮毁损+Nic吸入组;STO吸入组、嗅上皮毁损+STO吸入组。在染毒8w时进行CPP及神经行为学实验的观察检测。3.计算小鼠体重增长率及脾脏指数、胸腺指数的变化,探讨ETS、Nic、STO对小鼠体重增长与免疫力的影响;免疫比浊法检测小鼠外周动脉血清中的补体C3、C4及免疫球蛋白IgA、IgG、IgM水平,研究ETS及成分对小鼠非特异性免疫功能的影响。4.通过立体定位仪进行小鼠脑区定位,PowerLab多通道生理信号采集与处理系统记录嗅吸ETS、Nic后小鼠嗅球、伏隔核、黑质脑区电位的变化。5.免疫组织化学方法检测各组小鼠嗅球、海马、皮层等脑区的GABA、nAChR及NMDAR的变化。结果:1.小鼠成瘾性实验(CPP)检测结果:(1)染毒4w时ETS暴露组小鼠CPP效应没有显著差异性(P>0.05);染毒8w时ETS暴露组小鼠与空白组及4w组比较产生明显的CPP效应(P<0.05);(2)ETS+嗅上皮毁损组、Nic、STO染毒后CPP检测结果与空白组比较,没有统计学意义(P>0.05)。2.神经行为学实验结果:(1)小鼠自主活动、洞板实验实验结果:ETS暴露组与空白组比较自主活动次数明显增加(P<0.05),探洞次数明显减少(P<0.05);Nic暴露组自主活动次数、探洞次数都明显增加(P<0.05);其他组与空白组比较均没有明显差异(P>0.05)。(2)Morris水迷宫实验中,ETS暴露组、嗅上皮毁损+被动吸烟组、STO暴露组第一次穿越安全目标的潜伏期时间明显长于空白组(P<0.05),平均游泳速度造模组均低于空白组(P<0.05),ETS暴露组、嗅上皮毁损+Nic吸入组、STO暴露组穿越安全目标的次数均低于空白组(P<0.05)。3.(1)体重增长率,ETS暴露组、STO暴露组小鼠明显低于空白组(P<0.05);小鼠脾脏指数,ETS暴露组与空白组比较明显降低(P<0.05);(2)ETS组小鼠外周动脉血清中C3、C4、IgA、IgG水平均明显低于空白组(P<0.05);Nic吸入组、嗅上皮毁损+被动吸烟组小鼠血清中IgA、IgG水平均明显低于空白组(P<0.05)。4.小鼠嗅球、伏隔核、黑质OERP结果:(1)小鼠嗅球OERP:给予尼古丁气味刺激时,小鼠嗅球部位诱发电位与自发电位波形相似,频率基本无变化,振幅偏小约0.1V;给予ETS刺激时,小鼠嗅球部位诱发电位由自发电位的双肩波变为单肩波,频率减少一半,振幅基本无变化。(2)小鼠伏隔核OERP:给予尼古丁气味刺激时,小鼠伏隔核部位诱发电位与自发电位比较,振幅显著升高,平均约增加0.075V,频率约减少一半;给予ETS刺激时,小鼠伏隔核部位诱发电位与自发电位比较,振幅有所增高,频率有下降,但变化不明显。(3)小鼠黑质OERP:给予尼古丁气味刺激时,小鼠黑质部位诱发电位与自发电位比较,由正性波变为负性波,且振幅明显增加约0.5V,频率降低约一半;给予ETS刺激时,小鼠黑质部位诱发电位与自发电位比较,振幅有基本无变化,频率下降明显。5.免疫组织化学结果:(1)GABA在小鼠大脑皮层、海马部位的表达,ETS暴露组与空白组比较阳性细胞数量明显减少,Nic组与空白组比较变化不明显。(2)nAChR在大脑皮层的表达,ETS吸入组阳性表达明显增加,Nic吸入模型组与与空白组比较阳性表达差异不明显。(3)Glu受体NMDAR在小鼠大脑皮层、纹状皮质的表达,ETS吸入组、Nic吸入组与空白组比较阳性表达明显增加。结论:1.长期ETS暴露能够引发小鼠产生CPP,而且嗅觉通路可能在成瘾中起作用。2.长期接触ETS、STO导致小鼠学习记忆能力下降及其它神经行为学改变。3.ETS、STO降低小鼠体重增长率及小鼠非特性性免疫功能。4.ETS、Nic可诱发小鼠嗅球、伏隔核、黑质等部位产生特征性OERP电位变化。5.ETS、Nic暴露引起嗅球、大脑皮层、海马等部位神经递质及受体表达的变化。