研究目的：马兜铃酸（AAs）广泛存在于多种中草药材中，可直接通过饮用中草药进入人体，而且含有AAs的植物还可以污染周围土壤与地下水。目前对AAs的研究包括肾毒性、致癌性或心血管毒性，鲜有对AAs对生物体能造成神经毒性的报道，但有临床报道中发现AAs在临床上有过会引起视神经损害的案例，但对AAs的神经毒性作用机制尚未有研究。模式生物斑马鱼在神经发育、神经行为、细胞凋亡、免疫荧光上的研究技术非常成熟，在神经毒性研究中具有优势，所以本课题选用斑马鱼研究AAs的神经毒性及其作用机制。研究结果可用于评价AAs药物或食材的毒性、对其毒性的全面认识及不同毒性之间的联系具有一定的参考价值，对AAs人体健康风险评估具有现实意义。
　　研究方法：对于AAs神经毒性的研究包括三个部分。第一部分：对斑马鱼胚胎进行AAs全程（8-120hpf）暴露，通过发育毒性、行为实验、氧化应激与凋亡生化指标，以及肌肉HE染色与运动神经元检测，确定AAs神经毒性效应及主要作用途径。第二部分：为排除AAs肾毒性干扰神经毒性的研究，通过斑马鱼神经与肾脏发育周期不同将暴露窗口分为三个窗口，通过不同窗口暴露的发育毒性以及神经行为毒性确定神经发育的敏感性窗口。第三部分：在筛选出的神经敏感性窗口进行暴露，对氧化应激与凋亡等生化指标进行检测，通过AO染色评价凋亡细胞发生，使用Cyp1a品系斑马鱼研究药物代谢途径，对运动神经元和肌肉纤维进行检测评价，最后通过上述检测结果中的眼部凋亡细胞增加与运动神经元增殖现象对相关基因进行检测并通过原位杂交进行验证。
　　研究结果：（1）AAs相对高浓度暴露会造成斑马鱼胚胎/仔鱼畸形甚至死亡，主要畸形表型为肾性水肿等，在触摸反应、运动活力检测、运动速度检测等行为实验中，1和2μΜ组总体表现行为指标上调，而4μΜ组总体行为表现下调或者无差异性。随后分析发现1和2μΜ暴露组在氧化应激检测中发现脂质氧化上升且凋亡增多，肌肉纤维HE染色观察未见变化但次级运动神经元腹背轴突出现了增殖，证实了AAs对斑马鱼的神经毒性的存在。（2）不同窗口的暴露中，发育毒性中的肾毒性水肿畸形在24-48hpf与48-72hpf中分别在12μΜ与8μΜ出现，说明这两个窗口为肾毒性敏感性窗口，8-24hpf窗口暴露直到16μΜ都未出现肾毒性畸形，结合斑马鱼早期运动神经元发育周期猜测此窗口为神经毒性敏感性窗口，行为实验中，8-24hpf暴露窗口在自主运动、触摸反应、活力检测、运动速度检测等实验中总体表现出行为指标的上调，48-72hpf肾毒性敏感窗口暴露行为指标总体表现下调或无变化。8-24hpf暴露窗口在闪光刺激实验也出现了显著性变化。（3）对8-24hpf窗口暴露组进行氧化应激和凋亡等生化指标进行检测发现脂质氧化与超氧化物歧化酶活性增加并且凋亡增多，AO染色发现处理组斑马鱼眼部凋亡增加，并且代谢酶在眼部被大量激活。肌肉纤维未发生变化但是初级运动神经元与次级运动神经元均出现了增生。对相关基因进行检测发现与视觉感光相关基因（crx、rgr、opn1sw1、opn1sw2、rho）出现了下调与运动神经元相关基因（nog、hox）出现了上调并且在原位杂交实验上得到验证。
　　研究结论：AAs暴露可引起斑马鱼神经行为毒性，且可能通过氧化应激引发神经细胞凋亡和运动神经元异常增殖而引起。通过窗口暴露发育毒性结果发现斑马鱼AAs神经毒性窗口为8-24hpf，而48-72hpf为典型的肾毒性窗口，神经行为的检测结果也验证了这一点。而且8-24hpf窗口暴露组的斑马鱼眼部代谢酶表达量和细胞凋亡数据量均明显增加，这解释了仔鱼在行为实验中的畏光现象。同时运动神经元异常增殖解释了处理组斑马鱼速度活力上升的现象，对相关基因进行检测发现与视觉感光相关基因出现了下调，而与脊髓运动神经元相关基因出现了上调并得到原位杂交验证，从基因层面解释了斑马鱼行为上的畏光以及运动上升现象。总之，AAs对斑马鱼具有明显的神经行为毒性，8-24hpf为其敏感暴露窗口，且神经毒性的发生，主要通过氧化应激引起眼部神经细胞凋亡及运动神经元异常增殖，以及视觉感光基因和基因运动神经元基因的异常表达而引起。