研究目的烟曲霉是曲霉病最常见的病原体,目前三唑类为曲霉病一线用药。然而,随着烟曲霉唑类耐药率逐年上升,给临床曲霉病的治疗带来了巨大挑战。因此,对烟曲霉唑类耐药机制的探索十分重要。目前对烟曲霉唑类耐药机制的研究主要为cyp51介导的唑类耐药与外排泵的过表达,而在琥珀酰化修饰水平对烟曲霉唑类耐药的调控作用的相关研究尚未涉及。本研究从烟曲霉的临床分离株入手,通过体外药敏试验,了解烟曲霉对临床常用抗真菌药物的敏感性,为临床用药提供参考;然后对鉴定所得的烟曲霉唑类耐药株进行唑类靶基因、外排泵等基因检测,了解烟曲霉可能存在的耐药机制;进一步采用液相色谱-质谱联用分析技术对烟曲霉标准株（敏感株）和唑类耐药株进行琥珀酰化修饰组学研究,对琥珀酰化修饰蛋白进行功能分类,从而了解琥珀酰化在烟曲霉唑类耐药过程发挥的作用。最后,通过体外棋盘微量液基稀释法测定烟酰胺联合伊曲康唑是否具有增效的作用。本课题旨在为烟曲霉唑类耐药机制的研究提供更多的方向,为临床烟曲霉感染的治疗提供新的参考方案。研究方法第一部分,对患者流行病学资料进行汇总整理,并采用ITS（internal transcribed spacer region）、Ca M（calmodulin）及BT2（β-tubulin）基因进行菌种鉴定。同时,对烟曲霉进行4种临床一线抗真菌药物的体外药敏试验,研究其体外药敏特性。第二部分,对药敏试验中筛选出的烟曲霉唑类耐药株进行cyp51A基因的测序,并与AF338659进行序列比对,并通过q-PCR对唑类耐药株进行文献报道的耐药相关基因cyp51A、mdr1、mdr2、mdr3、atr F、及crd1B的表达水平进行检测。第三部分,使用液相色谱-质谱联用分析技术对烟曲霉标准株及耐药株的琥珀酰化修饰组学进行检测,通过GO、KEGG等数据库对鉴定所得的琥珀酰化修饰蛋白进行生物信息学分析。第四部分,根据美国临床实验室标准化协会制定的M38-A2指南,通过体外棋盘微量液基稀释法测定烟酰胺联合伊曲康唑对抗烟曲霉是否具有增效作用。研究结果第一部分,本研究共收集到27株烟曲霉临床分离株,体外药敏试验结果显示,有2株烟曲霉对伊曲康唑耐药,其余菌株均对伊曲康唑敏感;27株烟曲霉对伏立康唑、泊沙康唑及两性霉素B均表现为敏感。第二部分,耐药株CZZJ100527的cyp51A基因测序结果为TR34/L98H,且cyp51A基因的表达水平显著高于敏感株;CZZJ100527耐药株中mdr1、mdr2、atr F及cdr1B基因表达较唑类敏感株显著上调（P＜0.05）;而CZZJ100528耐药株未发现cyp51A基因突变,且上述耐药基因未见明显上调。第三部分,烟曲霉标准株Af293中1920个蛋白质具有9203个琥珀酰化修饰位点,这些琥珀酰化修饰蛋白主要富集在蛋白质翻译、代谢与合成过程,文献报道耐药相关蛋白Cyp51A、Hap E（AFUA＿1G10760）、Mdr1、Mdr2、Abc C、Erg6、Hsp90、Cna A均存在琥珀酰化修饰位点;烟曲霉耐药株与标准株的差异琥珀酰化修饰分析显示,耐药株琥珀酰化修饰水平低于敏感株,这些差异修饰蛋白主要富集在代谢和蛋白质翻译过程,上述耐药蛋白Mdr2、Erg6、Hsp90均出现了修饰位点的改变。第四部分,烟酰胺对27株烟曲霉的MIC值范围为12.8mg/m L-25.6mg/m L,在与伊曲康唑联用时,伊曲康唑对唑类敏感株的MIC降低了1-3个稀释度,对唑类耐药株的MIC降低了6-7个稀释度。结论烟曲霉唑类耐药是由多因素共同调控的,本研究中涉及的烟曲霉唑类耐药株并非均发生cyp51A突变及外排泵基因表达的改变,提示烟曲霉唑类耐药可能存在其他原因。烟曲霉中琥珀酰化修饰蛋白主要参与烟曲霉的代谢与蛋白质翻译过程,同时,琥珀酰化修饰可能与烟曲霉唑类耐药相关。烟酰胺具有抑制烟曲霉的活性,与伊曲康唑联合使用时具有增效作用,且对唑类耐药株增效作用更强。