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砷(arsenic,As)广泛分布于自然界,是一种常见的环境毒物和人类致癌物,能对植物产生严重的毒害作用。羊栖菜(Sargassum fusiforme (Hary.)Setehel)是一种重要的经济藻类,但是羊栖菜能在藻体积累大量的As,尤其是毒性较高的无机As,严重危害了羊栖菜的食用安全。研究羊栖菜中As的吸收代谢过程,鉴定和分离羊栖菜中与As响应相关的基因,有助于阐明羊栖菜对As吸收转运的机制,对保障羊栖菜的食用安全、推动我国羊栖菜产业发展具有重要的意义,羊栖菜砷吸收转运机制的阐明是羊栖菜砷阻控技术研发的重要基础。
本论文以浙江洞头县的羊栖菜为实验材料,分析了羊栖菜中As的含量、形态、分布、羊栖菜对As的吸收动力学、不同外源物质对羊栖菜对三价砷和五价砷吸收及外排的影响;采用转录组测序技术(RNA-Seq )和数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling,DGE)相结合的方法,研究了羊栖菜在50μmol/LAs处理0h和6h后的基因表达,并选择了表达倍数差异较高的甲基丙二酸半醛脱氢酶(methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase,MMALDH)基因,利用转基因技术将其转入拟南芥中异源表达,研究其在拟南芥中的功能。
主要研究结果如下:
(1)羊栖菜中砷的含量在成熟期可达84.37mg/kgDW,各形态砷含量依次为As(Ⅴ)>As(Ⅲ)>一甲基砷(monomethylarsonic acid, MMA)>二甲基砷(dimethylarsinic acid,DMA),其中无机砷占总砷的68%-86%。而无机砷中As(Ⅴ)总量占50%以上,有机砷含量则很少。
(2)羊栖菜各部位中砷的含量依次为假根>叶>气囊>茎;未处理的羊栖菜中砷在亚细胞分布含量依次为:细胞壁>细胞器>细胞液;5μmol/L和50μmol/LAs处理后,羊栖菜各部位砷含量均增加,但含量多少变为:细胞壁>细胞液>细胞器。但5μmol/L砷处理时,砷的增加量主要在细胞壁,而50μmol/L处理时,As的增量主要集中于细胞质。
(3)羊栖菜对海水中的As具有较强的富集作用,成熟期羊栖菜中As含量可达海水中的As含量的两万多倍。吸收动力学研究发现羊栖菜对五价砷的吸收速率显著高于三价砷,五价砷的Vmax约是三价砷的2倍,Km值约是三价砷3倍。
(4)羊栖菜对As(Ⅴ)的吸收受磷的抑制,但不受甘油影响,As(Ⅲ)刚好相反。矾酸钠可以显著增加羊栖菜对As(Ⅴ)的外排,但是对羊栖菜中As(Ⅲ)的外排没有影响。碳酰氰基-对-氯苯(Carbonylcyanide-p-chlorophenyl hydrazone,CCCP)和甘油可以抑制三价砷的外排,但对五价砷的外排影响不大。
(5)采用RNA-Seq和DGE相结合的方法,分离得到了羊栖菜中2046个在50μmol/LAs处理0h和6h后的差异表达基因,并选取其中5个基因采用实时荧光定量PCR方法验证了DGE数据的可靠性。基因信息学分析发现这些差异表达基因主要涉及到光合作用、丙酸代谢、氨基酸降解、肌醇磷酸盐代谢、RNA降解、氧化磷酸化和谷胱甘肽代谢等多个代谢途径。
(6)选择了在50μmol/LAs处理0h和6h差异表达倍数较高的MMALDH基因作为研究对象,通过转基因技术将其在拟南芥中表达,结果发现,表达羊栖菜MMALDH基因的拟南芥植株对As的抗性增强,体内砷的含量降低,表明MMALDH基因在拟南芥对As的吸收和抗性方面发挥重要作用。
本论文以浙江洞头县的羊栖菜为实验材料,分析了羊栖菜中As的含量、形态、分布、羊栖菜对As的吸收动力学、不同外源物质对羊栖菜对三价砷和五价砷吸收及外排的影响;采用转录组测序技术(RNA-Seq )和数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling,DGE)相结合的方法,研究了羊栖菜在50μmol/LAs处理0h和6h后的基因表达,并选择了表达倍数差异较高的甲基丙二酸半醛脱氢酶(methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase,MMALDH)基因,利用转基因技术将其转入拟南芥中异源表达,研究其在拟南芥中的功能。
主要研究结果如下:
(1)羊栖菜中砷的含量在成熟期可达84.37mg/kgDW,各形态砷含量依次为As(Ⅴ)>As(Ⅲ)>一甲基砷(monomethylarsonic acid, MMA)>二甲基砷(dimethylarsinic acid,DMA),其中无机砷占总砷的68%-86%。而无机砷中As(Ⅴ)总量占50%以上,有机砷含量则很少。
(2)羊栖菜各部位中砷的含量依次为假根>叶>气囊>茎;未处理的羊栖菜中砷在亚细胞分布含量依次为:细胞壁>细胞器>细胞液;5μmol/L和50μmol/LAs处理后,羊栖菜各部位砷含量均增加,但含量多少变为:细胞壁>细胞液>细胞器。但5μmol/L砷处理时,砷的增加量主要在细胞壁,而50μmol/L处理时,As的增量主要集中于细胞质。
(3)羊栖菜对海水中的As具有较强的富集作用,成熟期羊栖菜中As含量可达海水中的As含量的两万多倍。吸收动力学研究发现羊栖菜对五价砷的吸收速率显著高于三价砷,五价砷的Vmax约是三价砷的2倍,Km值约是三价砷3倍。
(4)羊栖菜对As(Ⅴ)的吸收受磷的抑制,但不受甘油影响,As(Ⅲ)刚好相反。矾酸钠可以显著增加羊栖菜对As(Ⅴ)的外排,但是对羊栖菜中As(Ⅲ)的外排没有影响。碳酰氰基-对-氯苯(Carbonylcyanide-p-chlorophenyl hydrazone,CCCP)和甘油可以抑制三价砷的外排,但对五价砷的外排影响不大。
(5)采用RNA-Seq和DGE相结合的方法,分离得到了羊栖菜中2046个在50μmol/LAs处理0h和6h后的差异表达基因,并选取其中5个基因采用实时荧光定量PCR方法验证了DGE数据的可靠性。基因信息学分析发现这些差异表达基因主要涉及到光合作用、丙酸代谢、氨基酸降解、肌醇磷酸盐代谢、RNA降解、氧化磷酸化和谷胱甘肽代谢等多个代谢途径。
(6)选择了在50μmol/LAs处理0h和6h差异表达倍数较高的MMALDH基因作为研究对象,通过转基因技术将其在拟南芥中表达,结果发现,表达羊栖菜MMALDH基因的拟南芥植株对As的抗性增强,体内砷的含量降低,表明MMALDH基因在拟南芥对As的吸收和抗性方面发挥重要作用。