本文重点研究灰飞虱不同细胞色素P450单加氧酶(氧化酶)对杀虫剂的降解催化能力。灰飞虱是东南亚地区水稻的重要害虫,尤其是上世纪60年代以来,危害逐步加重,防控研究也广泛展开。灰飞虱是几种重要农作物病毒病的传播媒介,传播的病毒病甚至能使稻谷减产50%,严重威胁水稻生产和世界粮食安全。为此,生产上花费大量财力进行防控,以避免灰飞虱危害造成产量损失。在中国,上世纪60年代灰飞虱就通过传播水稻条纹叶枯病和黑条矮缩病等病毒病导致过严重减产,自此以后,灰飞虱一直被认为是重要害虫。近期研究发现,灰飞虱田间种群对不同杀虫剂已陆续产生了抗药性,而且目前已经日趋普遍,并进行了大量研究,现已弄清解毒能力增加是抗药性的重要机制,而P450氧化酶在杀虫剂解毒和抗药性形成中均发挥了重要作用。P450是不同生物体内广泛存在的亚铁血红色蛋白,所组成的P450氧化酶系可以利用不同化合物进行酶促反应,是生物体内具有多种生理功能的重要酶系。在昆虫体内,P450氧化酶可以降解杀虫剂,并促进多种内源化合物的转化。一般情况下,抗药性昆虫体内某些P450氧化酶基因会出现过量表达,由此认为这些P450参与了相关杀虫剂的解毒代谢,是抗药性相关解毒酶。但由于昆虫体内P450基因众多,而体外表达又有一定的技术难度,直至上世纪90年代以后,才开始有部分抗药性相关基因被体外表达并证实具有杀虫剂降解催化能力,至今,一种杀虫剂仅鉴定了有限几个P450降解酶,尚不足以研究P450氧化酶的底物专一性。本文依据P450氧化酶的家族特性以及已报道的抗药性相关基因,选择灰飞虱体内的4家族和6家族,以及已报道与抗药性相关的和不相关的P450基因,利用昆虫Sf9细胞进行体外表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳检测和CO差光谱分析,利用传统P450氧化酶活力探测底物对表达蛋白进行酶活力检测,同时与不同杀虫剂温育,检测不同基因表达产物对不同杀虫剂的降解催化能力。结果发现昆虫体内不仅6家族和9家族成员可以降解澳氰菊酯,4家族成员也可以,而且不仅抗药性相关P450可以降解杀虫剂,有些抗药性不相关的P450也可以降解杀虫剂,进一步提高了对杀虫剂代谢和抗药性形成的认识。现将具体结果总结如下:1、灰飞虱4家族P450氧化酶CYP439A1v3对澳氰菊酯的降解活力目前已经证实来自其他5种昆虫的10种P450氧化酶可以降解溴氰菊酯,在溴氰菊酯抗性灰飞虱体内,也发现有4种P450氧化酶CYP353D1v2、CYP6FU1、CYP6AY3v2和CYP439A1v3出现过量表达,本实验室对前3种已经进行了体外表达和功能验证,发现其中只有CYP6FU1可以催化澳氰菊酯降解。本研究重点验证CYP439A1v3对澳氰菊酯的降解能力,实验首先利用昆虫Sf9细胞对CYP439A1v3进行体外表达,而后通过测定温育杀虫剂的减少和代谢物的生成,确定重组表达的P450氧化酶蛋白对不同杀虫剂的降解活性。结果利用SDS-PAGE电泳检测表达的目标蛋白条带,以及利用CO差光谱分析均证实,本研究成功表达了完整的CYP439A1v3重组酶蛋白。利用探测底物进行酶活力检测,发现重组表达的酶蛋白可以选择性代谢对硝基苯甲醚、乙氧基香豆素和乙氧基异吩恶唑,活力分别为7.77±1.21,1.32±0.14 and 0.36±0.36 nmol min-1 mg protein-1,仅对荧光素前体底物Luciferin-H EGE没有活性。与不同杀虫剂温育,随后用HPLC,LC-MS和MS/MS检测分析发现,重组表达的CYP439A1v3可以通过羟基化将溴氰菊酯氧化成低毒的4’羟基溴氰菊酯,但对吡虫啉、噻嗪酮、毒死蜱和氟虫氰无催化代谢作用。本研究不仅证实溴氰菊酯抗性灰飞虱体内过量表达的CYP439A1v3确实具有降解澳氰菊酯的功能,而且还揭示了昆虫中第一个可以降解溴氰菊酯的P450氧化酶4家族成员,该结果有助于进一步研究P450氧化酶的底物专一性,以及更好地进行抗药性治理。此外,本研究结果还表明对硝基苯甲醚是检测CYP439A1v3活力较好的探测底物,甚至可以用于检测与之相关的澳氰菊酯抗性,但荧光素前体底物Luciferin-H EGE不行。2、灰飞虱抗药性不相关的CYP417A2v2对吡虫啉的降解活力一般认为昆虫抗药性品系体内过表达的P450氧化酶参与杀虫剂的氧化解毒代谢。本研究选择在抗吡虫啉、溴氰菊酯和毒死蜱的灰飞虱体内均正常表达的4家族P450基因进行体外功能表达,以便检测抗药性不相关的P450氧化酶是否可以催化杀虫剂的降解代谢。实验从灰飞虱P450基因4家族中随机挑选出CYP417A2v2、CYP425A1v2和CYP4DJ1三个基因,利用昆虫细胞Sf9进行体外表达,目标蛋白检测发现,CYP417A2v2和CYP425A1v2表达成功,但CYP4DJ1没有表达出目标蛋白。进一步利用CO差光谱分析并检测酶活力发现,只有CYP417A2v2表达产物(CYP417A2v2)具有完整酶蛋白的吸收光谱和催化活性。本研究共检测了 3种传统的P450氧化酶探测底物(硝基苯甲醚、乙氧基香豆素和乙氧基异吩恶唑)和5种常用杀虫剂(吡虫啉、溴氰菊酯、噻嗪酮、毒死蜱和氟虫氰),结果发现传统P450氧化酶探测底物中,CYP417A2v2可以选择性催化对硝基苯甲醚和甲氧基香豆素的氧化,酶活力分别为3.76±1.22和1.63±0.37 nmol min-1 mg protein-1,但对乙氧基异吩恶唑无活性,表明对硝基苯甲醚和乙氧基香豆素可以用作检测CYP417A2v2活力的探测底物。对于杀虫剂,CYP417A2v2仅对吡虫啉表现出催化活性。将CYP417A2v2与杀虫剂一起温育,随后利用HPLC,LC-MS和MS/MS检测母体化合物的减少、代谢产物的生成,以及代谢产物的化合物种类,结果发现CYP417A2v2与吡虫啉一起温育产生了新的代谢产物——吡虫啉的低毒氧化代谢产物4’羟基吡虫啉,而且吡虫啉的减少与代谢产物的增加与温育时间相关。这表明,并非所有具有杀虫剂降解能力的解毒酶,均会被筛选并在抗药性品系中高表达,一些尚没有突变上调的具有杀虫剂降解能力的解毒酶,在随后的抗药性进化中可能发挥作用。本研究揭示的不同昆虫P450氧化酶的杀虫剂解毒特性,对于更好地理解和治理害虫抗药性均具有重要意义。3、灰飞虱P450氧化酶基因CYP426A1对氟虫氰的降解活力进一步拓展研究抗药性非相关P450氧化酶基因发现,在抗吡虫啉、澳氰菊酯和毒死蜱的灰飞虱体内均正常表达的4家族P450基因CYP426A1,可以有效降解氟虫氰。同样利用昆虫Sf9细胞对CYP426A1进行体外表达,而后利用SDS-PAGE电泳检测表达的目标蛋白条带,利用CO差光谱分析酶蛋白的特征吸收光谱,通过测定温育杀虫剂的减少和代谢物的生成,确定重组表达的P450氧化酶蛋白对不同杀虫剂的降解活性。结果发现,CYP426A1重组基因可以在昆虫Sf9细胞内表达出完整的目标酶蛋白,利用传统的P450氧化酶探测底物检测酶活力发现,重组表达产物对3种探测底物均有明显活性(对硝基苯甲醚、乙氧基香豆素和乙氧基异吩恶唑的活力分别为:5.21±0.71、1.01±0.12和0.73±0.26nmol min-1 mg protenn-1),表明这些底物均可用于检测CYP426A1的活力。杀虫剂降解实验发现,5种常用杀虫剂中,CYP426A1只能催化氟虫氰降解(代谢产物尚在进一步分析),对吡虫啉、溴氰菊酯、噻嗪酮和毒死蜱均没有明显的催化作用。CYP426A1在已检测的抗性灰飞虱品系中均未见过量表达,但这些抗性品系中没有氟虫氰抗性品系,因此,CYP426A1虽然被证实可以降解氟虫氰,但是否会被氟虫氰筛选并在抗性发展中发挥作用,尚有待进一步研究。