细胞内微环境粘度在生命过程中起着关键作用,例如蛋白质和其他生物分子在细胞膜中的扩散过程。微环境粘度的异常变化也是各种严重疾病的重要因素或指标,如脑血栓、动脉硬化、阿尔兹海默症甚至恶性肿瘤等。因此,迫切需要开发用于微环境粘度变化的测试工具。近年来,荧光技术因其具有高灵敏度、高选择性、非侵入性检测、长时间实时监控以及重现性好等优势,已成为监测细胞内微环境粘度变化的重要研究工具之一。另外,近红外激发的双光子荧光显微技术已经成为生物医学研究中非常重要的成像工具。本文结合双光子荧光技术及粘度探针目前的研究现状,分别设计合成了基于咔唑-苯甲醛结构、咔唑-噻唑结构和香豆素-吲哚结构的双光子粘度荧光探针,并对其生物应用进行了深入的研究。第二章以咔唑基团作为荧光母体构建了一种具有双光子性质的脂滴靶向型粘度荧光探针CBA。在365 nm光激发下,探针CBA在非粘性介质中易形成TICT激发态,整个分子处于扭曲状态,并通过非辐射跃迁方式释放内部能量,从而发出微弱荧光。然而,随着粘度的增加,自由旋转受到抑制,分子处于共平面状态,从而荧光恢复。另外,荧光成像实验表明,探针CBA能快速通过细胞膜定位于脂滴中,具有良好的膜通透性,并且与脂滴商业染料尼罗红(Nile Red)复染有较高的共定位系数,可以对活细胞中脂滴的粘度变化进行荧光成像。第三章基于咔唑-噻唑结构设计合成了具有双光子性质的粘度荧光探针CB-V,电子供体咔唑与电子受体苯并噻唑之间形成D-π-A结构,可用于检测生物体内微环境粘度的异常变化。光谱实验表明,在粘性介质甘油中,CB-V在602 nm处发射出强荧光,荧光强度提高了约9.6倍,表现出较好的粘度响应。此外,探针CB-V对pH、极性不响应并表现出优异的选择性和光稳定性。将CB-V应用于细胞和活体成像,表现出良好的生物相容性,并能够对生物体内微环境粘度变化进行双光子成像。第四章以常见且易得的香豆素为双光子荧光团,将其与具有线粒体靶向基团的吲哚盐通过π键连接起来,形成D-π-A结构,构建了基于香豆素-吲哚结构的线粒体靶向型双光子粘度荧光探针Mito-V。光谱实验表明,随着粘度从1.7 cP增加到953 cP,探针Mito-V在634 nm处的荧光强度增强了约22倍,表现出良好的粘度响应。此外,探针Mito-V还表现出许多优点,例如选择性高、pH和光稳定性好、线粒体定位能力强和生物毒性低等。生物成像实验表明,探针Mito-V能对经外源刺激物刺激后的活细胞及斑马鱼体内的粘度进行双光子成像,并且双光子成像图分辨率明显优于比单光子的。此外,还将探针Mito-V用于炎性小鼠成像,结果表明炎性小鼠的荧光强度比正常小鼠高约2.1倍。