目的:　　结肠癌是常见的恶性消化道肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。结肠癌的侵袭转移是影响结肠癌治疗的疗效、预后和复发的主要因素。因此，亟待阐明结肠癌侵袭（invasion）转移（migration）新的分子机制，发现新的预测结肠癌侵袭转移和预后的分子标志，并探索有效的靶向干预手段。　　Eph家族是目前最大的酪氨酸激酶受体家族，1987年，EphA1首次被克隆成功，其命名来自于获取该基因的细胞来源，亦即促红细胞生成素的肝细胞（erythropoietin-producing hepatocyte，Eph）。Eph家族作为酪氨酸激酶受体，与其细胞表面的配体Ephrin结合，可调节细胞的生长和分化，介导细胞-细胞间接触，以及细胞迁移和聚集。　　EphB2可参与肿瘤细胞的迁移和侵袭，神经轴突导向、骨骼重塑、血管发生、胚胎组织的发育等。EphB2在很多肿瘤组织中表达异常，且在人结直肠癌、胃癌、前列腺癌和黑色素瘤中，都具有EphB2基因突变。在人正常结直肠组织中，EphB2和其配体EphrinB2共表达，而在人结直肠癌中，EphB2和EphrinB2的表达明显高于相邻正常黏膜组织。与之相反，也有报道提示EphB2却在人结直肠癌中表达下调。EphB2对结直肠癌肿瘤侵袭转移的生物学效应也存在着分歧：有研究表明，EphB2可通过加速细胞缺氧，或者通过wnt通路调控细胞粘附和迁移，进而抑制结直肠癌的侵袭转移。而也有研究表明，EphB2下调后，会通过E-cadherin抑制结直肠癌肿瘤细胞的迁移和侵袭。　　原癌基因Rac1是小GTP酶Rho家族的成员，在细胞黏附、细胞运动及细胞转化中发挥重要功能，Rac1在多种肿瘤中高表达或异常激活，同肿瘤的恶性转化、侵袭转移等过程密切相关。成为GTP活化形式的Rac1，进而激活下游靶蛋白p21活化激酶(p21-activated kinase1,PAK1)，活化后的PAK1能够进一步激活下游MAPK（mitogen-activated protein kinase）信号通路（如p38、JNK、ERK这三条通路），进而调节肿瘤细胞的黏附、运动、侵袭和转移。　　在乳腺癌细胞中，由EphrinB2激活的EphB4可导致Abl依赖的CrkII磷酸化，抑制Rac1，通过抑制上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT），从而抑制细胞迁移和侵袭。但是EphB2能否通过Rac1介导，激活其下游PAK1-MAPK信号轴，以影响结直肠癌侵袭转移的作用则未见报道。　　基于上述研究背景，提出以下科学假说：EphB2可与其配体EhprinB2结合,通过Rac1的介导激活PAK1-MAPK（p38、JNK、ERK）的磷酸化，从而促进结肠癌的侵袭转移。　　方法:　　本课题利用高表达EphB2的LoVo以及SW48细胞系，成功筛选出四株稳定低表达EphB2的LoVo-shEphB2#1、LoVo-shEphB2#2和SW48-shEphB2#1、SW48-shEphB2#2细胞系，利用上述筛选成功的低表达EphB2稳转细胞系，通过细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验以及Transwell细胞侵袭实验，初步观察低表达EphB2对结肠癌肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。并在体内实验中，观察低表达EphB2对裸鼠结肠癌肺转移的影响。进一步，将成功构建的pENTER-EphB2重组质粒瞬时转染LoVo和SW48结肠癌细胞系，以高表达EphB2,观察高表达EphB2对结肠癌肿瘤细胞迁移能力和侵袭能力的影响。　　为进一步明确EphB2影响癌肿瘤细胞侵袭转移的效应，同时阐明信号传导机制，使用上述体外低表达EphB2稳转细胞系和体内低表达EphB2裸鼠结肠癌肺转移模型，以及高表达EphB2瞬转细胞系；并使用EphB2的配体EphrinB2作为激动剂，以及Rac1抑制剂单独或共同作用，在体内外探究EphB2是否通过Rac1介导，并通过其下游分子PAK1-MAPK（p38、JNK、ERK）信号通路影响结肠癌细胞侵袭转移的作用。本课题旨在阐明EphB2促进结直肠癌侵袭转移的作用及其分子机制，为抗肿瘤治疗提供新的干预靶点及策略。　　结果:　　一．EphB2促进结肠癌的侵袭转移　　1.高表达结肠癌细胞系的选择：　　通过Western-Blot选取EphB2表达量比较高的结肠癌细胞系，选择LoVo以及SW48细胞系作为本课题的研究对象。　　2.低表达EphB2在体外和体内实验中均可抑制结肠癌的侵袭转移　　成功筛选出四株低表达EphB2稳转细胞系LoVo-shEphB2#1、LoVo-shEphB2#2以及SW48-shEphB2#1、SW48-shEphB2#2。细胞划痕结果显示：与相应的对照组（LoVo-NC、SW48-NC）相比，划痕后24h及48h，LoVo-shEphB2#1、LoVo-shEphB2#2以及SW48-shEphB2#1、SW48-shEphB2#2稳转细胞迁移距离明显近于对照组。Transwell细胞迁移结果显示：与对照组相比，低表达EphB2的LoVo-shEphB2#1、LoVo-shEphB2#2稳转细胞系迁移细胞数明显减少，差异具有极显著性意义（p＜0.01），低表达EphB2的SW48-shEphB2#1、SW48-shEphB2#2稳转细胞系效应与LoVo稳转细胞系相同，差异具有极显著性（p＜0.001）。该结果提示，低表达EphB2可抑制结肠癌肿瘤细胞的迁移能力。　　Transwell细胞侵袭实验结果显示：与对照组相比，两株低表达EphB2稳转LoVo细胞系和两株低表达EphB2稳转SW48细胞系均可显著抑制结肠癌肿瘤细胞的侵袭能力,具有极显著性差异（p＜0.001）。该结果提示，低表达EphB2可抑制结肠癌肿瘤细胞的侵袭能力。　　裸鼠肺转移模型结果显示：与Vector组相比，shEphB2#1及shEphB2#2稳转细胞系可减少裸鼠结肠癌肺转移灶的数目，具有显著性差异（p＜0.01）。该结果提示低表达EphB2可在体内抑制小鼠结肠癌的肺转移。　　3.高表达EphB2可促进结肠癌肿瘤细胞的迁移和侵袭　　成功构建pENTER-EphB2高表达重组质粒，使用pENTER-EphB2重组质粒瞬时转染LoVo细胞系和SW48细胞系。细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验结果显示：与Vector相比，pENTER-EphB2重组质粒可促进结肠癌肿瘤细胞的迁移能力，差异具有统计学意义（p＜0.05）。Transwell侵袭实验结果显示：与Vector相比，高表达EphB2可促进人结肠癌肿瘤细胞的侵袭能力，差异具有统计学意义（p＜0.05）。该结果表明，高表达EphB2可促进人结肠癌细胞系的迁移和侵袭能力。　　二．EphB2促进结肠癌侵袭转移的分子机制　　1．EphB2通过Rac1促进人结肠癌肿瘤细胞的侵袭转移　　2．EphB2通过Rac1激活PAK1-MAPK通路，进而促进结肠癌的侵袭转移　　结论:　　使用体外低表达EphB2稳转细胞系和体内低表达EphB2裸鼠结肠癌肺转移模型，以及高表达EphB2瞬转细胞系；并使用EphB2的配体EphrinB2以及Rac1抑制剂单独或共同作用，在体内外探究EphB2是否通过Rac1介导，并通过其下游分子PAK1-MAPK（p38、JNK、ERK）信号通路，影响结肠癌细胞侵袭转移的效应及其分子机制。实验结果表明，EphB2可与其配体EhprinB2结合,通过Rac1的介导，激活PAK1-MAPK（p38、JNK、ERK）通路的磷酸化，从而促进结肠癌的侵袭转移。本课题旨在阐明EphB2促进结肠癌侵袭转移的作用及其分子机制，为抗肿瘤治疗提供新的干预靶点及策略。