波尔山羊-兔异种克隆胚胎连续核移植及克隆胚移植研究

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本试验首先以经过接触抑制、新鲜消化的波尔山羊耳部成纤维细胞作为核供体,以超排家兔卵母细胞为受体,构建波尔山羊-兔异种克隆胚,然后进行了异种克隆胚连续核移植及异种克隆胚移植研究。旨在观察异种克隆胚(原代)与异种继代克隆胚早期发育的差异性以及探索山羊-兔异种克隆胚在山羊体内继续发育的可能性,为发展动物克隆技术提供理论和实践依据。 在山羊-兔异种克隆胚的连续核移植研究中,共构建原代重构卵858枚,经电融合后,获得重构胚440枚,重构卵融合率为51.3%,经体外培养后,获得桑椹胚155枚,囊胚45枚,囊胚率10.2%。随后,分别以获得的异种原代和异种继Ⅰ代克隆桑椹胚卵裂球为核供体移入去核的兔卵母细胞中,共构建继Ⅰ代重构卵73枚,继Ⅱ代重构卵20枚。在原代重构胚和继代重构胚发育率比较研究中,共挑选出145枚原代重构卵与上述73枚继Ⅰ代重构卵、20枚继Ⅱ代重构卵,经电融合后,进行体外共培养,所获得的重构胚分别为90枚、58枚及14枚,即融合率分别为62.1%、79.5%和70%。这162枚重构胚经过体外共培养后,卵裂率分别为72.2%、75.9%和28.9%;囊胚率分别为10%、13.8%和0。试验结果表明:融合率方面,原代、继Ⅰ及继Ⅱ代重构卵之间无显著差异(p>0.05);早期胚胎发育率方面,继Ⅰ代重构胚高于原代重构胚,但差异不显著(P>0.05),相反,继Ⅱ代却大大低于前两者,差异极为显著(P<0.05),并且在本试验中没有获得继Ⅱ代桑椹胚或囊胚;发育速度方面,继Ⅰ代明显快于原代,两者发育至囊胚所需时间分别为4~5d和5~6d,正常情况下相差1~2d,差异突出表现在体外培养后的第1个24h,在此期间,继Ⅰ代重构胚能发育到8~16细胞期,而原代重构胚却只能发育到4~8细胞期,其至有些胚胎只能达到2细胞期,但在随后的培养时间内发育速度又无差异。 在克隆胚移植研究中,试验分原代胚移植组和继代胚移植组,共移植受体羊43头,原代胚78枚,继代胚12枚,最终没有获得克隆后代。①原代移植组,移植克隆胚后,有6头受体山羊停止发情并维持1个月以上,其中1头达到60天,期间出现妊娠症状,在其返情后腹腔镜探查发现,一侧子宫体明显比另一侧粗大。②继代胚移植组,有2头受体母羊在移植胚胎后30天才返情,检测血清内孕酮含量,没有发现持续居高现象。试验结果表明:异种原代克隆胚移植后,在山羊体内形成早期着床,而继代克隆胚没有形成着床。
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