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鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum,MG)感染是危害养禽业重要的呼吸道传染病之一,由于MG通常与其他呼吸道病原混合感染,给临床MG感染的诊断带来困难。为探讨MG黏附蛋白的反应原性,建立一种特异性好、敏感性高的诊断MG感染的方法,本研究以肉鸡鸡毒支原体感染为研究对象,分离鉴定病原并建立了套式PCR诊断方法;同时对黏附蛋白mgc2进行克隆与表达分析。方法:采集发生自然感染的呼吸道疾病的肉鸡的肺脏、气囊、气管分泌物,实验室进行病原的分离培养,通过对病原的初步鉴定(L型细菌鉴定、菌落形态观察、染色镜检、红细胞吸附试验)、PCR扩增与测序等方法进行MG病原鉴定;并对目前常用的5对引物(gapA-F/gapA-R、16s rRNA-F/16s rRNA-R、mgc2-F1/mgc2-R1、mgc2-F2/mgc2-R2、LP-F/LP-R)进行灵敏性比较,筛选出灵敏度最高的引物建立套式PCR检测方法,同时对其特异性、敏感性进行检测;最后对MG的黏附蛋白mgc2进行克隆与原核表达,采用Western blot分析是否具有反应原性。结果:(1)MG分离与鉴定:试验共分离出36株MG菌株。其中有3株来自MG单纯感染病例,从3~20日龄的肉鸡场分离得到,33株来自MG混合感染病例,从21~40日龄的肉鸡场分离得到。(2)MG套式PCR检测结果:通过比较5对引物对MG的灵敏度,可得以mgc2基因设计的引物灵敏度最高,能检测出的MG的最低浓度为57.6 pg/μL,用此引物建立的套式PCR检测方法能够扩增基因片段大小为300 bp,与GenBank收录的相关序列同源性为98%,而与大肠杆菌、沙门氏菌、鸡滑液囊支原体均无交叉反应,能够检测出DNA的最小量为0.18 fg/μL。通过对安徽、山东省部分地区疑似MG的50只病死鸡进行检测,阳性检出率为80%。(3)鸡毒支原体的黏附蛋白mgc2原核表达结果:将mgc2基因序列中一个编码Trp的密码子TGA成功突变为TGG,突变后的mgc2基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,构建了重组质粒pET/mgc2,经IPTG诱导,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中高效表达分子量约为39.6 kDa的融合蛋白。Western blot分析表明该融合蛋白具有反应原性。结论:(1)建立的MG套式PCR检测方法特异性强、敏感性高。(2)成功表达了有良好反应原性的黏附蛋白mgc2。