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金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花,具有清热解毒、疏散风热、广谱抗菌抗病毒等功效。绿原酸、黄酮和环烯醚萜类成分作为金银花的主要药效物质基础,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝利胆等广泛的药理活性,广泛应用在医药和保健产业等[1]。金银花及其中成药的临床疗效与金银花的品质紧密相关,因此本研究结合现有的金银花质量评价体系,提出新思路与新观点,从根本上阐释金银花化学成分积累的生物合成途径与信号转导途径,对于系统地阐释金银花化学成分合成机制的生物学本质具有重要的科学意义。金银花化学成分的积累同时受基因调控与外部环境的影响,故本文将金银花的遗传因素和环境因素二者结合起来,一方面以药效活性成分为导向,利用相关功能基因及其调控网络系统地阐释活性成分的生物合成途径;另一方面分析与环境因素紧密相关的组蛋白甲基化水平,从表观遗传修饰方面来阐释金银花活性成分积累的机制。因此本研究基于“组蛋白甲基化—转录调控—基因表达一化学成分”假说,将表观遗传学与传统遗传学相互结合,以金银花为供试材料,以5-氮杂胞苷为切入点,以组蛋白甲基转移酶与去甲基化酶为研究对象,以金银花绿原酸、黄酮和环烯醚萜类成分的含量为导向,以功能基因调控网络为桥梁,分析相关基因的表达水平以及检测组蛋白第三亚基四号赖氨酸(H3K4)和组蛋白第三亚基九号赖氨酸(H3K9)的甲基化水平,从而探讨组蛋白甲基化与金银花化学成分之间的相关性,并筛选出与化学成分相关的组蛋白甲基化候选分子标记。主要研究结果如下:(1)从金银花转录组数据中获得并克隆得到4条组蛋白甲基转移酶(HMT1、HMT2、HMT3与HMT4)与4条组蛋白去甲基化酶(HDT1、HDT2、HDT3与HDT4),其共同参与维持金银花组蛋白甲基化水平的稳定。(2)对金银花组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶进行生物信息学分析,结果表明HMT1和HMT4为组蛋白H3K9甲基转移酶,与H3K9甲基化相关,此外,HMT4还参与H3K4的甲基化,HMT2和HMT3与精氨酸的甲基化有关;HDT1和HDT2与H3K9的去甲基化有关,HDT3参与H3K4的去甲基化,HDT4对H3K4和H3K9都有去甲基化作用。(3)对金银花供试材料分别进行5个浓度(20、40、60、80、100μM)的5-氮杂胞苷溶液处理,于1、2、3天后采集新鲜叶片,采用UPLC-MS/MS对绿原酸、黄酮和环烯醚萜类化学成分(绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、木犀草苷、马钱苷、马钱苷酸、断氧化马钱苷和7-表-马钱苷)进行含量分析,结果表明80 μM的5-氮杂胞苷溶液处理2天的金银花叶片中三大类化学成分发生了显著变化。(4)选择80μM的5-氮杂胞苷溶液处理2天的金银花叶片为材料,采用Real-time PCR技术分析金银花叶片中HMT、HDT和相关功能基因的表达水平,与空白对照组比较,结果表明HMT1和HMT4的表达水平显著下降,DT2的表达水平显著上升。(5)同样选择结果(4)中处理条件下的金银花叶片为材料,分析组蛋白H3K9和H3K4泛甲基化水平,与空白对照组比较,发现H3K9me1/2/3和H3K4me3水平显著下降。(6)H3K9me3与转录抑制有关,推测H3K9me3水平的下降会引起对PAL、CHI、CHS、FNSⅡ1、FNSⅡ2的转录抑制能力下降,从而造成这些基因的表达水平以及下游代谢产物木犀草素含量的上升;H3K4me3与转录激活有关,推测H3K4me3水平的下降会对HQT和8HD1的转录激活能力下降,进而导致这些基因的表达水平和相关下游产物绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C、马钱苷、马钱苷酸、断氧化马钱苷和7-表-马钱苷含量的下降。(7)基于此,本论文将其应用于4个不同产地(昆明、北京、武当和巨鹿)金银花的组蛋白甲基化水平与化学成分之间的相关性研究,结果表明昆明产地与北京产地的金银花比较,H3K4me2/3水平较低,H3K9me3水平偏高,且与北京产地的金银花组蛋白H3K4me2/3和H3K9me3水平都存在显著性差异;昆明产地与巨鹿产地的金银花比较,组蛋白H3K9me3水平较高,且与巨鹿产地的金银花组蛋白H3K9me3水平存在显著性差异。并对H3K4me2/3和H3K9me3水平有显著性差异的产地昆明与北京、昆明与巨鹿分别进行绿原酸、黄酮和环烯醚萜类成分的相对含量分析,结果发现昆明产地的绿原酸、黄酮和环烯醚萜类成分的含量比北京、巨鹿产地的都低。结合前四章的研究结果,推测H3K4甲基化可能正调控金银花绿原酸和环烯醚萜类的生物合成途径,H3K9甲基化可能负调控金银花黄酮类的生物合成途径。综上所述,认为H3K9me3水平与黄酮类成分木犀草素的含量呈负相关,H3K4me3水平与绿原酸类和环烯醚萜含量呈正相关。组蛋白H3K4me3和H3K9me3可作为金银花三大化学成分质量评价的候选分子标记。