随着水禽养殖业的快速发展,鸭病越来越受到重视,其中鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的一种主要传染病。有关DHV-1的分子生物学相关研究进展缓慢,其基因组结构和蛋白组成只是预测并且还存在差异,对病毒蛋白的功能研究国内外还未见报道。本研究通过对DHV-1 JX株进行基因组序列的测定与分析,并对其编码结构蛋白的VP0和VP1基因进行原核表达和免疫活性检测,希望为DHV-1的诊断、分子流行病学研究和疫苗的研制提供科学依据。本研究主要完成了以下研究工作:(1)根据GenBank上已发表的DHV-1基因组序列设计9对互相重叠的特异性引物,以JX株RNA为模板,RT-PCR扩增不同的目的基因,分别克隆到pMD18-T载体中,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,对阳性克隆进行测序,最后拼接出JX株基因组的核苷酸序列,得到7582bp核苷酸序列,并将JX株基因组序列提交到GenBank,登录号为:EF093502。基因组序列包括5’-UTR的部分序列、3’-UTR的部分序列和一个的ORF(长6750bp,编码一个含有2249个氨基酸的多聚蛋白)。基因组结构为:5’UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’UTR。(2)运用DNA Star软件,对JX株基因组序列与GenBank上已发表的其他不同DHV-1毒株的基因组序列进行同源性比较和遗传进化分析。结果表明,JX株与A66株(DQ886445)和C80株(DQ864514)的同源性为99.5%、亲缘关系最近,JX株与GenBank上已发表的其他DHV-1核苷酸序列的相似性都在94%以上,表明JX毒株与世界其他地方不同的DHV-1分离株之间,病毒基因组具有较高的同源性。(3)根据DHV-1 JX株基因组序列,设计含有BamHI和XhoI酶切位点的VP0基因引物,含有EcoRI和XhoI酶切位点的VP1基因引物,以JX株RNA为模板,RT-PCR扩增VPO和VP1基因。将VP0和VP1基因分别克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28-VP0和pET-28-VPl,随后将重组质粒转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示重组融合蛋白VP0和VP1的分子量分别约为32kDa和30kDa。可溶性分析确认重组VP0和VP1蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。经Western-blot分析证明重组VP0和VP1蛋白均具有良好的免疫学活性。综上所述,本研究对DHV-1 JX株进行基因组序列测定与分析,探讨其与不同DHV-1分离株的同源性与进化关系,表明目前世界范围内不同的DHV-1毒株之间具有较高的同源性。对DHV-1 JX株编码结构蛋白的VP0、VP1基因进行原核表达,经Western-blot分析证明重组的VP0和VP1蛋白均具有良好的免疫活性,可以作为进一步建立ELISA方法的检测抗原。