论文部分内容阅读
背景:肝癌是常见恶性肿瘤之一,具有高复发、高转移和预后不良等恶性特征。到目前为止,有效的肝癌治疗手段依旧缺乏。淋巴道转移(LNM)不仅是肿瘤转移主要方式,且是恶性肿瘤早期主要转移方式。淋巴道转移与肿瘤患者预后不良密切相关。小鼠肝癌Hca-P是大连医科大学自主从肝癌细胞克隆中分离出的亚克隆,其淋巴结转移率约为25%,转移能力较低,且只转移至淋巴结而非其他器官。因此,Hca-P细胞株是研究肝癌早期淋巴道转移的理想模型。CRK(CT10 regulator of kinase)家族最初作为致癌基因v-Crk产物发现于禽类肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中。CRK家族包括三个成员:CRKⅠ/Ⅱ和CRKL,前两者为相同mRNA通过选择性剪接产生;CRKL则由不同的基因编码,其结构与CRKⅡ相似。CRK本身不具备酶活性,通过SH2和SH3结构域作用于不同蛋白,使不能直接相互作用的信号分子发生关联,而广泛参与细胞内不同信号途径。CRKⅡ为CRK家族一员,与人类多种肿瘤相关,但其与肝癌的关系少有报道,与淋巴道转移关系研究未见报道。目的:1.构建pGPU6/GFP/Neo-sh RNA-CRKⅡ干扰质粒,稳转至Hca-P,获得CRKⅡ稳定下调单克隆细胞株;2.检测CRKⅡ下调对Hca-P体外增殖、克隆形成、迁移、侵袭及淋巴结黏附能力影响;3.构建pcDNA3.1/V5-His B-CRKⅡ真核表达载体,瞬时转染至Hca-P,在Hca-P中过表达CRKⅡ;4.检测CRKⅡ上调对Hca-P体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力影响;5.检测Hca-P中CRKⅡ表达变化对p130cas/CRK/Dock180/Rac1信号通路的影响。方法:1.根据CrkⅡSH3C碱基序列,设计特异性sh RNA及无关序列(NC),构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CRKⅡ及-NC表达载体;利用Lipofectamine?2000法转染细胞,G418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株;Western blot方法检测下调率。2.根据CrkⅡCDs,设计特异性引物;PCR扩增获得小鼠CrkⅡ的CDs全长,产物纯化后与pEASY-blunt simple克隆载体进行连接,获得pEASY-blunt simple-CRKⅡ,进行单双酶切及测序鉴定;将原核克隆质粒、pcDNA3.1/V5-HisB空质粒分别进行双酶切,纯化目的片段并连接,获得pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ表达质粒,进行单双酶切及测序鉴定。3.鉴定正确的pcDNA3.1/V5-His B-CRKⅡ瞬时转染Hca-P,Western blot检测上调率。4.台盼蓝计数法检测CRKⅡ下调对Hca-P增殖能力影响;CCK-8检测CRKⅡ上调对Hca-P增殖能力影响。5.软琼脂克隆形成法检测CRKⅡ上/下调对Hca-P克隆形成能力影响。6.Transwell小室法检测CRKⅡ上/下调对Hca-P体外迁移和侵袭能力影响。7.淋巴结黏附实验检测CRKⅡ下调对Hca-P黏附能力影响。8.检测在Hca-P细胞中CRKⅡ表达量水平变化对p130cas/CRK/Dock180/Rac1信号,通路分子蛋白表达水平的影响。结果:1.获得CRKⅡ下调shCRKⅡ-894-Hca-P和shCRKⅡ-852-Hca-P及阴性对照sh CRKⅡ-NC-Hca-P,sh CRKⅡ-894-Hca-P和shCRKⅡ-852-Hca-P下调率为52%和42%;2.pEASY-blunt simple-CRKⅡ克隆和pcDNA3.1/V5-His B-CRKⅡ表达质粒构建成功;3.相比shCRKⅡ-NC-Hca-P,shCRKⅡ-894-Hca-P在48、72、96h,shCRKⅡ-852-Hca-P在72、96h增殖力明显降低;shCRKⅡ-894-Hca-P克隆形成、迁移侵袭、淋巴结粘附能力降低76.1%、71.2%、79.9%、71.1%;sh CRKⅡ-852-Hca-P克隆形成、迁移侵袭、淋巴结粘附能力降低74.6%、71.4%、80.2%、55.2%;4.pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ-Hca-P中CRKⅡ水平是pc DNA3.1/V5-HisB-Hca-P的1.85倍;5.相比pc DNA3.1/V5-HisB-Hca-P,pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ-Hca-P在72、96h增殖力明显增强,克隆形成、迁移侵袭分别增高1.71、1.79、1.56倍;6.CRKⅡ上下调对p130/cas CRK/Dock180/Rac1通路影响不明显。结论:1.获得CRKⅡ稳定下调单克隆sh CRKⅡ-894-Hca-P和shCRKⅡ-852-Hca-P细胞株;2.CRKⅡ下调抑制Hca-P增殖、克隆形成、迁移侵袭、淋巴结黏附能力;3.构建pc DNA3.1/V5-His B-CRKⅡ表达质粒,转染至Hca-P,CRKⅡ水平上升85%;4.CRKⅡ表达上调促进Hca-P增殖、克隆形成、迁移侵袭能力;5.CRKⅡ表达上下调对p130cas/CRK/Dock180/Rac1信号通路影响不明显。