研究背景与目的肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的肝脏恶性肿瘤,大约占全部原发性肝癌的85-90%。我国是HCC大国,发病率高达25.7/10万,肝癌的新增病例数居世界首位。流行病学数据显示HCC患者确诊后5年生存率不到10%,目前已成为全球第2位癌症死因。在我国,HCC死亡率在部分城市占恶性肿瘤死亡率的第二位,部分农村则占第一位,每年肝癌患者的死亡人数居世界之首。HCC发病隐蔽,常发展至晚期才出现临床症状,恶性程度高,难治愈,预后常十分恶劣。目前HCC的治疗措施主要包括手术切除、肝移植、局部消融和肝动脉化疗栓塞术,并且研究已证实早期无症状小肝癌患者手术切除后可获得长期生存和良好的生存质量。然而,虽然积极的手术联合化疗和放疗治疗在临床中已经得到了广泛应用,但由于HCC易复发和易转移播散,并且临床上缺乏早期的诊断指标和方法,大部分患者都错过了手术治疗的最佳时机,HCC的临床治疗效果至今仍然十分不理想。因此,积极寻找新的HCC诊断和治疗的靶点对提高患者预后具有重要意义。HCC是正常肝细胞在多种因素作用下引起的一个多阶段渐进性发展的恶性疾病,其发病与环境、微生物感染、化学物质接触、免疫功能紊乱、遗传物质突变或表观遗传学改变等多种综合因素相关。目前研究已经证实肝炎病毒（主要为乙型和丙型）、食物中的黄曲霉毒素污染、酒精的过量摄入和吸烟等都是肝癌的主要致病因素。随着对HCC发生发展机制的深入研究,研究者发现HCC发生时,多种关键原癌基因（如β连环蛋白、PI3KCA、RAS等）被活化,多种抑癌基因（包括TRET、p53、CTNNB1、Axin1等）被灭活,多条信号通路发生异常（WNT、JAK/STAT、AKT、RAS/MAPK、生长因子信号通路等）。然而,HCC的发生发展是一个复杂的过程,迄今为止其分子机制仍未能完全阐明。因此,进一步明确HCC发生发展的分子机制,找到潜在的诊断和治疗分子靶点,有望为HCC的防治提供新思路,具有重要的临床意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是近年来发现的与众多疾病的发生发展密切相关的新型RNA分子。人类基因组中只有约1%的基因为蛋白质编码基因,约4%～9%的基因转录但其转录本不能编码蛋白质,其中长度大于200nt（核苷酸单位）的非编码转录本被定义为lncRNA。最初,lncRNA一直被认为是不具有功能的转录噪音和转录副产品,然而近年来越来越多的研究表明,lncRNA的表达具有组织和细胞特异性,是一类功能强大的调控分子。LncRNA能够参与基因调控的每个水平（包括转录前、转录和转录后水平）,进而广泛地参与基因组的调控,影响个体的生长发育和代谢以及细胞增殖、凋亡和分化等生命活动。随着对lncRNA生物学功能研究的不断深入,研究者发现lncRNA与众多疾病的发生发展密切相关,包括多种肿瘤、心血管疾病、呼吸系统疾病、免疫系统疾病等。目前研究较多的是lncRNA在肿瘤发生发展中的作用和机制。迄今已有较多文献报道lncRNA能够参与多种肿瘤（包括前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、白血病、肾癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌、HCC、食管癌等）的发生、生长和转移过程并发挥重要作用。目前大量研究结果显示lncRNA在HCC的发生发展过程中发挥着重要的调节作用,有望成为HCC诊断和治疗的新靶点。研究已证实多种lncRNA能够通过不同的机制,影响HCC的多种生物学过程,包括增殖、凋亡、转移、血管生成和干细胞特性等。Cao,C.等人发现lincRNAUFC1可受miR-34a负性调控,而其本身也可与mRNA稳定蛋白HuR直接结合,升高β-catenin的表达水平,促进肝癌细胞的增殖并抑制凋亡。另一种研究较多的lncRNA ANRIL能够直接与PRC2复合物结合,通过表观沉默KLF2基因从而调控细胞凋亡。Li,T.等人通过基因芯片技术发现,lncRNAZEB1-AS1在肝癌组织尤其是转移的HCC组织中高表达,其高表达与其启动子异常低甲基化密切相关,并且可正性调控其临近蛋白质编码基因ZEB1的表达,促进肝癌细胞的转移。Yuan,S.X等人在肝癌组织中发现一种表达上调的lncRNA-MVIH,可通过抑制磷酸甘油酸酯激酶的分泌,激活肿瘤诱导的血管生成作用,可作为HCC患者肝脏切除术后低无复发生存率的预测因子。最新研究发现,lncTCF7在HCC癌组织和肝脏肿瘤干细胞内均高表达,其能够招募SWI/SNF复合体结合于TCF7基因的启动子,从而调控TCF7基因的表达,进而激活Wnt信号通路,促进肝脏肿瘤干细胞的自我更新。此外,lncRNADREH、H19、HEIH、HOTAIR、HOTTIP、LALR1、MALAT-1、RERT、ucoo2mbe.2等都被发现参与HCC的发生发展。值得注意的是,lncRNA已被证实可稳定存在于血液、尿液等外周循环中,并且其在外周循环的含量与疾病的进展密切相关,有望成为一个诊断、实时监测和疾病防治的新型标志物。在肝癌患者血循环中,研究者也发现了若干种特异的lncRNA,且其水平可反应HCC的进展情况,有望成为新型诊断和治疗检测的标志物。Tang,.J.等人收集了 HCC患者术前和术后的血浆以及健康对照患者的血清,分别进行lncRNA表达谱芯片分析,最终发现RP11-160H22.5,XLOC₀14172和LOC149086在HCC表达明显高于无肿瘤对照,有望成为预测HCC发生发展的生物标志物,而XLOC₀14172和LOC149086同时在HCC转移患者体内高表达,有望成为HCC转移预测的生物标志物。虽然循环lncRNA产生和释放的机制尚不明确,但是其在HCC中表达的高特异性以及其检测标本的易获取性使得lncRNA有望成为HCC诊断和治疗的新靶点。综上所述,lncRNA在HCC发生发展过程中发挥重要作用,可稳定存在于外周循环中,且其水平可反应HCC的进展情况,因此,研究lncRNA对HCC的影响并探讨其功能和相关分子机制,对HCC的诊断和治疗具有重要意义。本研究通过基因芯片技术发现一种在肝癌组织和癌旁组织中差异表达的新lncRNA 分子—PTTG3P（pituitary tumor-transforming 3,pseudogene,垂体瘤转化因子3假基因）,研究其在肝癌中的表达情况及临床意义,以及其对肝癌细胞增殖、凋亡和转移能力的影响,进一步探究其具体的作用机制,旨在为肝癌的诊断和治疗提供新的靶点。研究内容与方法1.LncRNA PTTG3P的筛选、表达验证及其临床意义1.1基因芯片筛选在肝癌组织和癌旁组织中差异表达的lncRNA在3例经病理确诊为中分化HCC的肝癌组织和其相应的癌旁组织标本中进行lncRNA和mRNA表达谱芯片分析,通过聚类分析及其他生物信息学分析技术筛选在癌组织和癌旁组织中差异表达大于1.5倍且p<0.05的lncRNA和mRNA,并对差异表达的mRNA进行pathway分析,分析其可能的功能。1.2 RT-PCR检测lncRNA PTTG3P在肝癌组织和癌旁组织的表达水平。针对收集的46例HCC癌组织和配对的癌旁组织,采用经典Trizol法提取组织RNA,逆转录后,经RT-PCR检测并比较lncRNAPTTG3P的表达情况。1.3 LncRNA PTTG3P表达量与肝癌患者临床病理特征的相关性。收集46例HCC患者的基本资料（包括性别、年龄等）和临床病理特征,包括肿瘤大小、AFP水平、肝硬化情况、HBsAg、肿瘤个数、病理分级等,分析lncRNA PTTG3P表达量与这些临床病理特征之间的相关性。2.LncRNA PTTG3P的功能研究2.1构建稳定过表达和稳定干扰PTTG3P的肝癌细胞株构建稳定过表达lncRNA PTTG3P的慢病毒载体Lv-PTTG3P及对照空载慢病毒载体Lv-con,分别感染HepG2和Hep3B肝癌细胞后,经嘌呤霉素筛选后获得稳定过表达lncRNA PTTG3P的肝癌细胞株和对照细胞株,RT-PCR检测其过表达效率。此外,应用shRNA慢病毒载体稳定干扰HepG2和Hep3B细胞中lncRNA PTTG3P的表达,经嘌呤霉素筛选后,用RT-PCR检测稳定干扰效率,确保获得稳定干扰lncRNA PTTG3P的肝癌细胞株和对照细胞株。2.2 LncRNAPTTG3P对HepG2、Hep3B肝癌细胞生长能力的影响应用cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒和平板克隆形成实验评估lncRNA PTTG3P在体外对肝癌细胞增殖能力的影响。采用EdU实验检测细胞S期的变化情况,同时采用流式细胞仪检测细胞周期分布情况,进一步研究PTTG3P对细胞周期分布以及增殖能力的影响。采用APC/7AAD双染试剂盒,通过流式细胞仪检测PTTG3P对HepG2和Hep3B细胞凋亡的影响。此外,通过皮下分别注射稳定过表达PTTG3P的HepG2细胞和相应对照细胞株、稳定干扰PTTG3P的HepG2细胞和相应对照细胞,构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察PTTG3P对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。2.3 LncRNA PTTG3P对HepG2和Hep3B细胞侵袭转移能力的影响通过Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验分别检测PTTG3P对HepG2和Hep3B细胞迁移和侵袭能力的影响。随后,经脾注射稳定干扰PTTG3P的HepG2细胞和对照细胞株,构建裸鼠转移模型,观察PTTG3P在体内对肝癌细胞转移能力的影响。3.LncRNA PTTG3P促进肝癌细胞生长和转移的可能分子机制研究运用western blot技术检测稳定干扰PTTG3P和稳定过表达PTTG3P的HepG2、Hep3B细胞中与细胞增殖相关的关键基因（C-myc、CyclinD1、CDK4、CDK6、Rb和p-Rb）、与细胞凋亡相关的关键分子（Caspase3和Cleaved caspase3）、与EMT相关的关键基因（核转录因子Snail、Slug,上皮标志物E-cadherin,间质标志物N-cadherin）以及与肝癌生长和转移密切相关的信号通路蛋白（PI3K、AKT、磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT）的表达变化。结果1.基因芯片筛选得到lncRNAPTTG3P,PTTG3P在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织,并且其表达量与年龄呈负相关,与肿瘤大小呈正相关。1.1.基因芯片筛选得到大量差异表达的lncRNA,其中lncRNAPTTG3P在肝癌组织中表达上调。在3例经病理确诊为中分化HCC的肝癌组织和其相应的癌旁组织标本中进行lncRNA和mRNA表达谱芯片分析,通过生物信息学分析,筛选得到癌组织和癌旁组织中差异表达大于1.5倍且p<0.05的lncRNA共822个,其中513个lncRNA表达上调,209个lncRNA表达下调。差异表达大于1.5倍且p<0.05的mRNA共979个,其中449个基因表达上调,530个基因表达下调。Pathway分析结果显示,mRNA的表达变化主要与细胞周期的变化有关。在差异表达的lncRNA中,lncRNA PTTG3P在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织,差异表达倍数为 11.87,p=0.0016。1.2.LncRNA PTTG3P在肝癌组织中表达明显上调。我们通过RT-PCR检测了 PTTG3P在46例肝癌组织和配对癌旁组织中的表达水平,结果显示PTTG3P在肝癌组织中明显表达上调（p<0.05）。1.3.LncRNAPTTG3P表达量与年龄成负相关,与肿瘤大小呈正相关通过对PTTG3P表达量和46例HCC患者的临床资料进行分析,我们发现PTTG3P表达量与HCC患者的年龄呈负相关（p<0.05）,与肿瘤大小呈正相关（p<0.05）,而与性别、AFP水平、肝硬化情况、HBsAg、肿瘤个数、病理分级等无明显相关。2 LncRNA PTTG3P能够促进肝癌细胞生长和转移。2.1成功构建稳定过表达和稳定干扰PTTG3P的HepG2和Hep3B肝癌细胞株。对转染PTTG3P过表达慢病毒载体和对照慢病毒载体的HepG2和Hep3B细胞中PTTG3P的表达量进行RT-PCR检测,结果发现转染过表达PTTG3P慢病毒载体的HepG2和Hep3B细胞中PTTG3P的表达量明显高于对照细胞株（p<0.05）,表明稳定过表达PTTG3P的HepG2和Hep3B细胞以及对照细胞株均已成功构建。同时,利用慢病毒稳定干扰HepG2和Hep3B细胞内源性PTTG3P的表达,应用RT-PCR检测其稳定干扰效率,结果显示,在HepG2细胞内,PTTG3P干扰效率为34.53%（p<0.05）,在Hep3B细胞中为35.03%（p<0.05）,表明稳定低表达PTTG3P的HepG2和Hep3B细胞以及对照细胞株已成功构建。2.2 LncRNA PTTG3P促进HepG2和Hep3B肝癌细胞的生长CCK-8实验结果显示过表达PTTG3P能够促进细胞生长（p<0.05）而干扰PTTG3P则抑制肝癌细胞生长（p<0.05）。平板克隆形成实验也进一步证实了该结果（p<0.05）。EdU实验进一步说明,PTTG3P能够促进肝癌细胞进入S期（p<0.05）。流式细胞术的结果也证实,PTTG3P能够减少处于G1期的细胞数（p<0.05）,增加处于S和G2期的细胞数（p<0.05）。这些结果表明PTTG3P能够促进肝癌细胞G1/S的转换,从而促进细胞增殖。此外,通过流式细胞仪检测凋亡,结果显示干扰PTTG3P能够明显增加凋亡细胞比例（p<0.05）,而过表达PTTG3P则能减弱5氟尿嘧啶诱导的肝癌细胞凋亡（p<0.05）。在裸鼠皮下成瘤实验中,Lv-PTTG3P HepG2细胞形成的肿瘤的重量和体积都明显大于对照组（p<0.05）,而sh-PTTG3P组肿瘤的重量和体积均小于sh-con对照组（p<0.05）。这些结果说明PTTG3P能够在体内和体外促进肝癌细胞的生长。2.3 LncRNAPTTG3P促进肝癌细胞的转移Transwell小室迁移实验结果表明过表达PTTG3P显著促进HepG2和Hep3B细胞的迁移能力（p<0.05）而干扰PTTG3P后,HepG2和Hep3B细胞的迁移能力明显减弱（p<0.05）。在Boyden小室侵袭实验中,PTTG3P过表达能够明显增加穿过膜的肝癌细胞数（p<0.05）,然而,干扰PTTG3P后,穿膜细胞数明显少于对照组（p<0.05）。在裸鼠肝转移模型实验中,分别在裸鼠脾脏内注射sh-PTTG3P和sh-con HepG2细胞,30天后处死裸鼠,发现sh-PTTG3P组裸鼠在肝脏内形成的转移瘤数量明显少于sh-con组。3 PTTG3P通过激活PI3K/AKT信号通路,调控一系列与增殖、凋亡和EMT相关的基因表达,从而促进肝癌细胞的生长和转移。运用western blot技术检测稳定干扰PTTG3P和稳定过表达PTTG3P的HepG2细胞中与细胞增殖相关的关键基因（C-myc、CyclinD1、CDK4、CDK6、Rb和p-Rb）的表达情况,结果显示过表达PTTG3P能够明显升高C-myc（p<0.05）、CyclinD1（p<0.05）和p-Rb（p<0.05）的水平,反之,干扰PTTG3P则能明显下调C-myc（p<0.05）、CyclinD1（p<0.05）和p-Rb（p<0.05）的水平。PTTG3P对CDK4、CDK6和Rb的表达水平无明显影响。这说明PTTG3P可通过上调C-myc和CyclinD1的表达,进而升高p-Rb的水平,最终促进肝癌细胞的增殖。凋亡关键基因Caspase3和Cleaved Caspase3的western blot结果表明,干扰PTTG3P能够增加Cleaved Caspase3的活性（p<0.05）,而过表达PTTG3P则能够抑制5氟尿嘧啶诱导的Cleaved Caspase3活性（p<0.05）。EMT是影响细胞迁移和侵袭能力的一个重要方面。对EMT相关指标进行western blot检测,结果显示,在过表达PTTG3P的肝癌细胞中,核转录因子Snail、Slug蛋白质水平明显升高（p<0.05）,上皮标志物E-cadherin表达下调（p<0.05）,间质标志物N-cadherin则表达无明显变化。而在sh-PTTG3P肝癌细胞中,Snail（p<0.05）、Slug（p<0.05）表达水平降低,E-cadherin表达水平升高（p<0.05）,N-cadherin表达无明显变化。这些结果表明PTTG3P可通过上调Snail和Slug的表达,下调E-cadherin的表达,从而促进肝癌细胞的EMT过程,Western blot检测了PTTG3P对细胞中相关信号通路蛋白的影响,结果发现,在HepG2细胞中,过表达PTTG3P能够引起磷酸化蛋白质p-PI3K（p<0.05）和p-AKT（p<0.05）水平升高,而干扰PTTG3P则能够降低p-PI3K（p<0.05）和p-AKT（p<0.05）的水平。这说明过表达PTTG3P能够激活PI3K/AKT信号通路,而干扰PTTG3P则抑制PI3K/AKT信号通路。结论1.LncRNAPTTG3P在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织,且其表达量与患者.年龄呈负相关,与肿瘤大小呈正相关。2.LncRNA PTTG3P能够在体内和体外促进肝癌细胞的生长和转移。3.LncRNAPTTG3P能够激活PI3K/AKT信号通路,调控一系列与周期相关的基因（上调C-myc、CyclinD1和p-Rb的表达）、凋亡相关基因（下调Cleaved Caspase3的活性）和EMT相关基因（上调Snail和Slug的表达,下调E-cadherin的表达）的表达,从而促进肝癌细胞的生长和转移。