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杨树是近年来我国大力推广的速生树种之一,它不仅是重要的防风树种,也是重要的木材用树。但是,虫害是杨树育种中面临的一个严重问题,化学杀虫剂容易使害虫产生耐药性并污染环境。因此利用转基因技术培育抗虫杨树新品种已成为当前植物遗传改良的重要手段。本研究以热杨1号(PopulusXeuramericanacv.Reyang1)为实验材料,采用植物组织培养、植物基因工程和分子生物学的有关技术,建立了热杨1号的再生体系并对双抗虫基因遗传转化热杨1号进行了系统的研究,实验结果如下:
1.研究了不同外植体、不同激素浓度配比对热杨1号愈伤组织、不定芽和根诱导的影响,获得了热杨1号高效再生体系。实验表明以热杨1号叶脉为外植体的再生能力明显高于其他外植体,并筛选出诱导愈伤组织、不定芽和根的最佳培养基。切取叶脉接种在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5g/L的培养基上,经过1周左右开始出现愈伤组织,并且愈伤组织的诱导率高达90%;把愈伤组织接种到Ms+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L+椰子水5%+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5g/L的培养基上诱导不定芽再生,25d左右可看到不定芽的形成,诱导率达87%;再生芽在1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.15mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉5.5g/L的生根培养基上经过25d左右可诱导出根,生根率可达94%。
2.测定了愈伤组织对Kan的抗性,得出热杨1号愈伤组织对Kan的敏感的最佳浓度为50mg/L。利用农杆菌介导法和基因枪轰击法将一个构建在载体上的双抗虫基因(BtCryI基因和慈姑蛋白酶抑制剂基因API)转化热杨1号。
3.利用农杆菌介导法进行遗传转化的研究中发现预培养时间、共培养时间、乙酰丁香酮对热杨1号的遗传转化率均有较大影响。预培养2d、共培养24h,添加100mg/L的乙酰丁香酮的遗传转化率最高。共培养后转至MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L+椰子水5%+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5g/L培养基上进行分化筛选培养,3个月后,经过4-6次筛选的抗性愈伤组织部分分化出芽。转到1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.15mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉5.5g/L+Car100mg/L+Kan50mg/L培养基上进行生根筛选。
4.利用基因枪法进行遗传转化的研究中,预培养时间、轰击距离对热杨1号的遗传转化率有较大影响。确定了基因枪转化热杨1号的有关参数:轰击前,愈伤组织无需高渗预处理2d,轰击距离:6cm,轰击次数:1次。
5.经农杆菌介导法进行遗传转化所获得的47株转化植株中有45株苗PCR检测呈阳性。SouthernBlot检测的结果为4株苗有杂交信号。证明外源双抗虫基因已整合到热杨1号基因组中。
6.利用基因枪法进行遗传转化所获得的52株转化植株中有39株苗PCR检测呈阳性,SouthernBlot检测的结果为3株苗有杂交信号。证明外源双抗虫基因已整合到热杨1号基因组中。
本研究中我们建立了热带杨的双抗虫的遗传转化体系,为利用基因工程技术进行杨树育种提供了理论依据。