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目的胰腺癌增殖速度快,侵袭转移发生早,对化疗药物不敏感,被称为“癌中之王”。传统的胰腺癌研究模式将焦点集中于胰腺癌本身,而忽略了肿瘤微环境对胰腺癌细胞的影响,这可能是现阶段胰腺癌治疗效果欠佳的原因之一。本研究通过检测胰腺星状细胞对胰腺癌细胞侵袭转移的影响,对HGF/c-met信号通路在其中的作用及机制进行初步的探讨,旨在揭示肿瘤微环境在肿瘤恶性行为中的促进作用。方法1.测定PSCs对胰腺癌细胞株Panc-1,SW1990侵袭转移力的影响。收集PSCs的上清液作为条件培养基(PSC-CM),并通过细胞划痕实验测定其对两株胰腺癌细胞转移能力的影响;利用Transwell共培养体系将PSCs与胰腺癌细胞进行共培养,测定PSCs对胰腺癌细胞的侵袭转移的影响;2.测定PSCs对胰腺癌细胞上皮间质转换(Epithelial mesenchymal transition,EMT)的影响。将PSC-CM作用于胰腺癌细胞Panc-1,SW1990后,光镜下观察其形态的变化;利用RT-PCR,Western Blot法分别检测两株胰腺癌细胞E-cadherin、Vimentin的表达变化情况;利用细胞免疫荧光技术检测E-cadherin、Vimentin在胰腺癌细胞内的表达变化情况;3.检测HGF对胰腺癌细胞的EMT以及侵袭转移的影响。运用ELISA法分别检测胰腺星状细胞与胰腺癌细胞上清液中HGF的含量;运用RT-PCR,Western Blot法检测胰腺星状细胞与胰腺癌细胞胞内HGF表达的差异;采用si RNA技术干扰胰腺星状细胞胞内中HGF的表达,收集其上清液并测定其对胰腺癌细胞侵袭转移的影响;将胰腺星状细胞上清液中加入HGF-antibody,随后用其培养胰腺癌细胞,观察其对胰腺癌细胞EMT和侵袭转移的影响;将外源性HGF加入到胰腺癌细胞培养基内,观察胰腺癌细胞侵袭转移力的变化;4.检测HGF对胰腺癌细胞survivin表达的影响。将PSC-CM作用于胰腺癌细胞后,采用RT-PCR法、Western Blot法检测胰腺癌细胞内survivin基因的表达水平变化;在胰腺星状细胞条件培养基中加入HGF-antibody并培养胰腺癌细胞,观察癌细胞内survivin基因的表达水平变化;采用si RNA技术干扰胰腺癌细胞内survivin基因的表达,随后将其与胰腺星状细胞共培养,观察后者对其侵袭转移的促进作用是否被抑制;5.检测HGF对其受体c-Met表达的影响。将PSC-CM作用于胰腺癌细胞后,采用RT-PCR法、Western Blot法检测胰腺癌细胞内c-Met、p-Met基因的表达水平变化;在胰腺星状细胞条件培养基中加入HGF-antibody并培养胰腺癌细胞,观察癌细胞内c-Met、p-Met基因的表达水平变化;将胰腺星状细胞条件培养基中加入c-Met特异性抑制剂SU11274,随后培养胰腺癌细胞,观察癌细胞内c-Met、p-Met、survivin基因的表达水平变化;6.检测P53/P21对HGF/c-Met/survivin信号通路的影响。采用RT-PCR法、Western Blot法检测两株胰腺癌细胞内P53,P21的表达水平差异;采用P53抑制剂pifithrin-α干扰癌细胞内P53基因的表达,检测癌细胞内P21、c-Met、p-Met、survivin基因的表达水平变化;构建P53过表达质粒转染癌细胞使其胞内P53基因过表达,检测癌细胞内P21、c-Met、p-Met、survivin基因的表达水平变化;采用si RNA-P21干扰癌细胞内P21的表达,随后检测c-Met的表达水平变化;构建P21过表达质粒转染癌细胞使其胞内P21基因过表达,检测c-Met表达水平变化。结果胰腺星状细胞能够促进胰腺癌细胞(Panc-1,SW1990)发生上皮间质转换现象,并能促进胰腺癌细胞株Panc-1的侵袭转移,但对SW1990的侵袭转移能力无明显促进作用;胰腺星状细胞胞内以及其上清液中均能够检测到HGF的大量存在,而胰腺癌细胞胞内以及其上清液中则几乎没有,特异性阻断胰腺星状细胞内HGF的表达可以减弱胰腺星状细胞对Panc-1细胞侵袭转移的促进作用;外源性的HGF则可以诱导Panc-1细胞侵袭转移,而对SW1990无作用;HGF作用于癌细胞后,癌细胞内特异性受体c-Met表达水平无明显变化,而其磷酸化水平(p-Met)表达水平明显上升,特异性阻断HGF后,p-Met表达水平下降;运用SU11274干扰c-Met表达后,其磷酸化水平p-Met表达水平随之下降,survivin基因的表达亦随之下降;运用si RNA技术干扰癌细胞内survivin基因的表达后,胰腺星状细胞对胰腺癌细胞侵袭转移促进作用较之前明显下降;Panc-1细胞内P53,P21缺失,SW1990内P53,P21表达水平较高,将Panc-1细胞转染P53过表达质粒后,P21表达上调,c-Met表达水平下调;运用si RNA技术干扰SW1990细胞内P53的表达后,P21表达减弱,c-Met表达水平上调。将pifithrin-α处理后的的SW1990细胞与胰腺星状细胞共培养后,其侵袭转移能力较之前明显加强。结论胰腺星状细胞通过HGF/c-Met/survivin信号通路促进胰腺癌细胞的侵袭转移过程,这一信号通路受到P53/P21轴的负性调控。