论文部分内容阅读
[背景]肝纤维化是对酒精肝、脂肪肝等多种慢性肝损伤的一种补偿性修复过程。肝脏损伤时,静息的肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)转分化为具有增殖、收缩特性的肌成纤维细胞,表达α-SMA并分泌大量的细胞外基质,大量胶原沉积,造成肝脏结缔组织异常增生。纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化,甚至是肝癌。现已公认HSC活化是肝纤维化的核心环节,有效抑制HSC增殖和收缩,诱导活化HSC凋亡和衰老是抑制肝纤维化发展的重要方式。维持HSC活化需要大量的能量供应,抑制线粒体氧化功能能够逆转肝纤维化。另外,来自自分泌和旁分泌的TGF-β和IL-1β等因子的持续刺激也不断诱导HSC活化。阻断维持HSC活化的因素是抑制HSC活化的有效手段。有研究显示,静息的HSC储存大量脂滴(lipid droplet,LD),这些脂滴含有甘油三酯,视黄醇酯,胆固醇酯等物质,用于维持肝星状细胞正常生理功能。重要的是,HSC活化往往伴随着LD的消失。研究LD消失的机制或许能够寻找抑制HSC活化的新方向和新靶标。lncRNA-H19是已经被证实调控肝纤维化发生发展的重要分子,与脂肪酸,胆汁酸和葡萄糖等多种代谢方式有关。但是上述调控过程一般发生在肝细胞和胆管细胞中,其是否调控HSC的生理功能还不清楚。考虑到HSC在肝纤维化发生发展中的关键性作用,我们提出lncRNA-H19调控HSC脂滴代谢发挥促肝纤维化的作用的科学假说。另外,基于对lncRNA-H19的研究,我们寻找抑制lncRNA-H19的中药有效成分,并进一步探究其抗肝纤维化的具体机制。[方法]1.体外研究选取HSC-LX2细胞株作为本论文体外研究对象。Real-time PCR,western blot和免疫荧光实验检测目的基因,蛋白的表达情况;油红O染色和尼罗红染色检测细胞中LD含量;双荧光素酶报告基因实验检测lncRNA-H19启动子活性;荧光原位杂交检测细胞中lncRNA-H19水平;RNA免疫沉淀和共免疫沉淀用于检测多个蛋白与lncRNA之间的结合情况,另有多个分子实验被用来阐明其潜在机制。2.体内研究将48只ICR雄性小鼠随机分为6组(每组8只):正常对照组、CCl4模型组、CCl4+vector 组、CCl4+ad.shH19 组、CC14+DHA+ad.pNC 组、CCl4+DHA+ad.pH19组。肝组织的HE、Masson、Sirius Red染色表现肝组织结构与胶原沉积现象;α-SMA的IHC实验表现HSC活化情况;全自动生化仪检测血清中谷草转氨酶移酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、过硫酸铵(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原酶(Ⅳ-C)和Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)的表达;Real-time PCR和western blot分析原代HSC中目的基因,蛋白表达水平;免疫荧光双染检测肝组织中目的蛋白水平。[结果]我们的研究证实lncRNA-H19在HSC活化过程中表达增加,低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)促进了 lncRNA-H19 的转录表达。体内抑制lncRNA-H19表达可明显改善CC14诱导的小鼠肝纤维化的组织病理学特征;体外抑制lncRNA-H19表达能够抑制HSC活化,并伴随着HSC中LD含量的增加。更重要的是,lncRNA-H19降低甘油三酯水平,促进甘油三酯水解成脂肪酸,经线粒体氧化后供能;同时,lncRNA-H19也降低视黄醇水平,促进视黄醇水解生成视黄酸,调控多种纤维化因子的表达。机制上,lncRNA-H19调控甘油三酯代谢依赖于AMPKα/ACC信号通路,LncRNA-H19驱动AMPKα与LKB1相互作用,导致形成LKB1/AMPKα复合物,以促进LKB1磷酸化AMPKα,磷酸化的AMPKα通过激活下游分子ACC促进线粒体氧化蛋白CPT1A和PPARα的表达。另一方面,lncRNA-H19降低视黄醇代谢关键酶ADH3,使用ADH3抑制剂4-MP后能够逆转lncRNA-H19对视黄酸信号和纤维化蛋白的促进作用。接下来,我们筛选出了中药活性成分,发现双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)以剂量依赖的方式抑制了 lncRNA-H19的表达水平。基于对lncRNA-H19的研究,我们发现DHA通过降低lncRNA-H19恢复HSC脂滴含量,抑制HSC活化,改善肝纤维化。[结论]本论文的研究明确了 HSC脂滴代谢的调控机理与分子靶标lncRNA-H19,有助于揭示lncRNA-H19在HSC活化过程中所发挥的重要作用。在此基础上明确了 DHA抑制HSC脂滴代谢的分子机理。这些研究为揭示DHA的抗肝纤维化作用并使其成为有潜力的抗肝纤维化药物提供更为深入的理论与实验依据。