基于单克隆抗体的生物药物治疗已经成为应对威胁人类生命尤其是癌症等疾病的重要手段。大分子单抗存在组织(如实体瘤)穿透能力差、生产和储存成本高、价格昂贵等缺点,促使研究人员对抗体分子进行基因工程改造,如小型化(Fab、Sc Fv以及Nanobody)或发展基于新的结构骨架的抗体类似物或模拟物。纳米抗体是存在于骆驼血清中的缺失轻链的重链抗体可变区片段,是目前天然来源的具有完全抗原结合功能的最小抗体分子,具有组织穿透能力强、生产成本低、折叠能力强、易于结合蛋白裂隙表位以及在极端条件下稳定性高等优点。这使得纳米抗体成为新一代治疗性抗体开发过程中很有希望的候选分子。此外,纳米抗体的单域结构特性,使其成为研究抗体结构与功能以及设计新型抗体分子的良好材料。NBL42为本研究组前期从新疆双峰驼免疫噬菌体展示文库中筛选出来的的一个仅具有CDR3和两侧框架区的纳米抗体。该抗体对溶菌酶具有较高的特异结合活性和显著的酶抑制活性。分析该抗体序列,发现除具有较长的CDR3(17个氨基酸)外,在FR3序列中有三个氨基酸残基分别与目前已知的VHH抗体FR3区相应氨基酸残基不同,FR4中有一个氨基酸残基与多数VHH抗体不同。因此设想能否将该抗体的框架区作为CDR3移植的通用骨架。本研究的目的主要有三个方面:首先,分析NBL42纳米抗体结构与抗原结合活性之间的关系。其次,验证NBL42框架区能否作为CDR3移植肽抗体的通用骨架。最后,采用CDR移植方法制备抗CD47肽抗体,并对其进行活性分析。以期开发基于骆驼单域抗体的通用小分抗体片段移植架构,对今后新型抗体的设计提供实验基础。本研究的主要内容包括以下三部分:1.分析NBL42纳米抗体结构与抗原结合活性之间的关系首先采用DNA重组技术制备NBL42蛋白。以NBL42-LH的基因为模板,PCR扩增出不含前导区和铰链区的NBL42基因片段,构建到p ET30a表达载体,在大肠杆菌中诱导表达蛋白后再经过Ni柱纯化,经ELISA验证,去除了前导区和铰链区的NBL42纳米抗体与溶菌酶仍有较高的结合能力,非竞争ELISA的方法测得其亲和力常数(Kd)为8.33×10-7 mol/L。测得NBL42的IC50值为14.01μg/m L,显示其抑菌效果良好,且具有很高的酶抑制活性。NBL42纳米抗体在95℃能够保留64.60%的活性,说明VHH的CDR3衍生而来的抗体可以保留很好的热稳定性和高亲和力。其次通过ELISA实验,比较了在大肠杆菌不同部位表达的纳米抗体抗原结合活性,结果显示,可溶性的NBL42蛋白与包涵体形式复性的蛋白相比,前者有着更好的结合溶菌酶的活性;包涵体复性的c Ab-Lys3仍然具有与细胞周质c Ab-Lys3同样的抗原结合活性。2.基于NBL42框架区结构的CDR3移植肽抗体的抗原结合活性分析为了确定NBL42抗体的框架区FR3-FR4作为CDR3肽抗体移植骨架的可行性,进行以下研究:首先将NBL42抗体的FR3-FR4区作为受体,将VHHA4抗体的CDR3区作为供体,构建NBL42-A4CDR3重组抗体的DNA片段,将其连接到p ET32a表达载体上,对蛋白进行表达纯化,ELISA方法检测其与溶菌酶及蒜氨酸酶的结合特性。NBL42-A4CDR3重组抗体成功表达,ELISA结果表明,NBL42-A4CDR3获得了VHHA4的部分抗原结合活性,且与溶菌酶不结合。原来以包涵体形式表达的VHHA4,在其CDR3移植到NBL42的FR3-FR4框架区之后,获得了可溶性表达。NBL42和VHHA4的CDR3具有接近的氨基酸长度,除此之外二者序列上没有明显的相似性。其次选择c Ab-Lys3(结合溶菌酶,CDR3有19个氨基酸)和鼠单克隆抗体B6H12(结合CD47,即整合素相关蛋白)作为CDR3序列的供体,选择NBL42(结合溶菌酶)的FR3-FR4区作为CDR3序列的受体。采用全基因合成的方法,合成这两种CDR3移植肽抗体基因,并构建在p ET22b(+)表达载体上。Western Blotting结果表明,两种肽抗体均在大肠杆菌细胞周质中正确表达。但ELISA实验显示两种CDR3移植肽抗体不具备结合相应抗原的能力。3.抗CD47肽抗体的制备和活性分析本研究试图通过CDR移植的方法,寻找适合与抗原CD47结合的小分子抗体框架,采用了以下两种策略设计抗CD47肽抗体:一是采用文献报道的具有CDR移植潜力的纳米抗体c Ab BCII10(结合β内酰胺酶)作为骨架,将单抗B6H12的VHCDR3移植到c Ab BCII10的CDR3区域,构建移植抗体c Ab BCII10-B6H12H3,原核表达后验证其与CD47的结合能力。二是采用Qiu等的方法,直接将B6H12的VHCDR1和VLCDR3通过VHFR2融合在一起,构建CDR嵌合抗体B6H12/H1-FR2-L3,原核表达后验证其与CD47的结合能力。结果显示,两种移植抗体均能在大肠杆菌中表达。但ELISA实验表明,c Ab BCII10-B6H12和B6H12/H1-FR2-L3与CD47无特异结合活性。本研究系统分析了纳米抗体NBL42架区作为CDR3通用移植骨架的可能性,在对VHHA4的CDR3的移植中取得了初步成功,获得了供体抗体的部分抗原结合特异性,初步表明NBL42具有作为移植骨架的潜力。但是,采用其他三种来源的抗体移植没有获得成功,构建的肽抗体没有预期的抗原结合活性。可能与移植抗体的CDR3来源和氨基酸组成有密切关系。今后还需进一步分析CDR3序列在移植抗体中的作用,为阐明抗体结构与其活性之间的关系提供理论依据。