肺纤维化治疗是世界难题。因此,需要对其发病机制进行更深入的研究,寻找更多的治疗靶点。miR-146a在NF-κB信号通路具有负性调控作用。我们团队在前期研究发现miR-146a在干燥综合症合并肺纤维化的患者中表达异常,结合他人研究提示miR-146a可能参与肺纤维化的发生、发展。本课题拟通过观察肺纤维化模型中及细胞中miR-146a表达的变化情况,探讨miR-146a在肺纤维化过程中的作用和可能的分子机制。本学位论文由三部分组成:第一部分:miR-146a在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中的表达目的:研究博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中的miR-146a的表达变化。方法:实验分2组:对照组(saline)、模型组(BLM)。模型组采用气管内滴入博来霉素法建立小鼠肺纤维化模型,对照组滴入同体积生理盐水。分别于7,14,21,28天处死小鼠。HE染色检测肺组织病理变化,Masson法染色检测胶原沉积情况,羟脯氨酸含量测定肺组织中胶原含量,免疫组化法检测α-SMA、TGF-β1、I型胶原(COL I)和III型胶原(COL III)表达,采用Westerning-blot法检测肺组织Smad4蛋白表达情况,采用qRT-PCR检测miR-146a在肺组织中的表达。结果:1)与生理盐水组小鼠对比,博来霉素组小鼠在造模后7-28天呈现出进行性肺纤维化和肺泡炎现象,羟脯氨酸含量进行性增高,伴有肺组织中α-SMA、TGF-β1、I型胶原(COL I)和III型胶原(COL III)表达增加,于第21天时最明显,以上结果说明博来霉素诱导肺纤维化模型建立成功。2)采用qRT-PCR检测肺组织miR-146a表达结果显示在BLM组小鼠肺组织中miR-146a表达水平较Saline组低,且表达水平随着纤维化的进展而下调。3)Westerning-blot法检测肺组织Smad4蛋白水平,随着纤维化的进展也不断增高。结论:miR-146a在来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中表达下调,与肺纤维化的发展进程同步。第二部分miR-146a在肺成纤维细胞表型转换中的作用及分子机制研究目的:研究高表达和抑制miR-146a对小鼠肺成纤维细胞表型转化的影响。方法:采用不同浓度或在不同作用时间予TGF-β1诱导肺成纤维细胞,摸索诱导成纤维细胞转化的合适浓度和合适时间,并检测细胞中miR-146a表达的情况。将细胞分5组,留1组细胞不转染,其它4组将人工合成的miR-146a类似物(mimic)、mimic阴性对照物(miR-NC)、miR-146a抑制物(sponge)、sponge阴性对照物(sponge-NC)分别采用脂质转染法干预肺成纤维细胞中miR-146a的表达后,采用TGF-β1诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,WB法检测NIH/3T3细胞在TGF-β1诱导后a-SMA的表达情况及胶原表达情况。生物学信息预测软件和双荧光素酶报告基因检测miR-146a的直接靶基因。结果:1)浓度为10 ug/L、20 ug/L时,与0 ug/L(对照组)相比较a-SMA蛋白、胶原表达量明显增高,浓度为1 ug/L、10 ug/L、20 ug/L时,与0 ug/L(对照组)相比较miR-146a相对表达降低。在予浓度为10ng/ml的TGF-β1干预肺成纤维细胞后,在作用时间为2,3天时,与0天中的miR-146a降低。2)高表达miR-146a能降低Smad4的蛋白表达水平,同时也降低a-SMA、I型胶原和III型胶原的表达水平;抑制miR-146a在肺成纤维细胞中的表达,可以增加TGF-β1诱导Smad4的表达水平,同时也增加a-SMA、I型胶原和III型胶原的表达水平。CCK8法检测结果显示,与对照组比较,sponge组成纤维细胞的增殖能力增加。流式细胞术检测结果显示在miR-146a sponge组凋亡明显下降。3)miR-146a靶基因预测和证实运用生物信息学预测软件预测靶基因,发现Smad4为miR-146a靶基因,双荧光素酶报告基因检测证实miR-146a的靶基因为Smad4。结论:miR-146a通过靶向Smad4干预TGF-β1诱导肺成纤维细胞的表型转换。第三部分高表达miR-146a对模型小鼠肺纤维化的影响目的:研究高表达miR-146a对博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型的影响。方法:小鼠分为3组,空白对照组(saline)、阴性对照组(miR-NC)、miR-146a高表达组(mimic)。气管内滴入博来霉素造模,分别予尾静脉注射miR-146a mimic,miR-NC和生理盐水,在21天时qRT-PCR检测miR-146a表达情况,HE染色检测肺组织病理变化,Masson法染色检测胶原沉积情况,羟脯氨酸含量测定肺组织中胶原含量,免疫组化法检测α-SMA表达。结果:在miR-146a高表达组中小鼠肺组织中miR-146a表达较空白对照组及阴性对照组明显增高,提示干预成功。miR-146a高表达组肺纤维化及肺泡炎程度、羟脯氨酸含量、α-SMA较空白对照组及阴性对照组下降。结论:高表达miR-146a可以抑制博来霉素诱导的肺纤维化。综上,本课题通过研究,证实了miR-146a在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中表达下降,并与纤维化的进程同步,高表达miR-146a可以减轻博来霉素诱导的肺纤维化;并在细胞水平初步证实了miR-146a可通过TGF-β1/Smad信号通路参与肺纤维化的过程。为今后miR-146a用于肺纤维化的靶向治疗提供了实验依据。