斑马鱼已成为脊椎动物中最重要的发育生物学模式动物之一,但斑马鱼体内的基因敲除技术尚不成熟,不利于对斑马鱼基因的生物学功能进行深入的研究。2008年国际上出现了一种新的斑马鱼体内基因的敲除技术,即锌指核酸酶寡聚体库工程(Oligomerized pool engineering)进行基因敲除,简称OPEN法基因打靶技术。该技术能快速高效的敲除体内的基因,建立基因敲除品系。本实验室已筛选出斑马鱼POP3基因的355bp靶位点并针对靶位点构建了2个半位点锌指蛋白对应的质粒。本研究将该质粒转录形成加帽RNA,将其注射到一细胞期的斑马鱼胚胎中,发育24h时后收集胚胎,提取整体胚胎基因组,用靶位点两侧的引物进行PCR扩增,将经酶切分析可能有突变的PCR产物连入pMD18-T载体进行测序,检测OPEN法基因打靶技术的有效性。最近,国际上研究出一种类似OPEN法基因打靶技术的新方法TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)靶向基因敲除技术,具有根据需要选择任意的目标序列进行模块构建,在靶序列的模块构建上TALE具有更大的灵活性的优点。本文利用了这个新的分子生物学工具,用来自Xanthomonas TAL的序列模块,通过网站在线分析基因POP3的TALEN靶位点,筛选分析得到最合适的靶位点,构建了针对POP3第一个外显子核酸靶序列的重组核酸酶的质粒,旨在能特异打断目标基因以敲除该基因功能,最后检测所构建的TALEN质粒的打靶有效性。此外,实验室已有研究结果表明POP3和ATF4存在体外相互作用,为了进一步确定POP3与ATF4在斑马鱼体内的相互作用,用分别带有flag和myc标签的POP3和ATF4的引物进行PCR,再以PCR回收产物为模板进行转录得到分别带有flag和myc标签的POP3和ATF4 mRNA。将转录产物POP3和ATF4 mRNA共同注射到4-8细胞期的斑马鱼胚胎中,待其发育到Bud时期,收集胚胎。提取蛋白进行分两个方向进行免疫共沉淀实验,结果证明POP3与ATF4在斑马鱼体内确实存在相互作用。