【摘 要】
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杨树由于其优良的特性,在我国得到了大面积的推广种植。然而,近年来,由金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)引起的杨树腐烂病发生日益严重,导致大量的杨树死亡,造成了巨大的经济损失。虽然该病原菌是一种条件致病菌,常在寄主生长势衰弱时开始表现出症状。然而,一旦树体发病,并没有有效的措施进行防治,仅能通过使用化学农药、修剪病枝及移除枯死木等方法延缓病害的发生。近年来,以RNA干扰为核心
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杨树由于其优良的特性,在我国得到了大面积的推广种植。然而,近年来,由金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)引起的杨树腐烂病发生日益严重,导致大量的杨树死亡,造成了巨大的经济损失。虽然该病原菌是一种条件致病菌,常在寄主生长势衰弱时开始表现出症状。然而,一旦树体发病,并没有有效的措施进行防治,仅能通过使用化学农药、修剪病枝及移除枯死木等方法延缓病害的发生。近年来,以RNA干扰为核心的寄主诱导的基因沉默技术,为植物病害的高效防控提供了新的思路和手段。因此,为了探究利用RNA干扰技术用于杨树腐烂病防治的潜力,本研究开展了:1.胞外添加小干扰RNA(artificial small interference RNAs,asiRNAs)验证杨树腐烂病菌基因沉默系统的可行性;2.构建了基于烟草的病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)瞬时表达体系验证植物源的小干扰RNA可以跨界沉默病原菌的靶标基因;3.尝试建立高效的本氏烟、欧美杨组织培养体系,以获得稳定表达病原菌关键致病基因小干扰RNA的抗病转基因植株。主要结果如下:(1)胞外添加asiRNA可以较好地抑制金黄壳囊孢致病靶标基因的表达通过胞外添加两个致病关键基因(CcPmk1和CcSeg1)的asiRNA,发现Cc Pmk1和Cc Seg1基因的表达量均显著下调,表明asiRNA可以较大的干扰靶标基因的表达,并且Cc Pmk1和Cc Seg1的基因沉默菌株分别与其基因敲除突变体菌株表型相似。这表明基因沉默系统可适用于杨树腐烂病菌,且Cc Pmk1和Cc Seg1可以作为靶标基因用于后续研究。(2)利用本氏烟的病毒诱导的瞬时沉默体系可以沉默病菌致病靶标基因并抑制病菌的扩展通过在烟草叶片上瞬时表达phytoene desaturase(PDS)基因的病毒沉默载体,成功将本氏烟PDS基因沉默,烟草叶片表现出白化现象,表明该沉默体系可行。随后,利用该系统分别在烟草叶片上瞬时表达金黄壳囊孢Cc Pmk1基因以及与其具有较高同源性的灰葡萄孢Bc Bmk1基因的病毒沉默载体,并接种灰葡萄孢,结果显示病斑面积显著减小;而且不论瞬时表达Cc Pmk1沉默载体,还是瞬时表达Bc Bmk1沉默载体,均显著降低了灰葡萄孢Bc Bmk1基因的表达,从而抑制病菌的侵染。这表明植物体内表达的病原菌致病关键靶标基因的小RNA,可以有效抑制病菌的扩展。(3)本氏烟和欧美杨107组织培养体系的优化以及尝试建立抗病转基因植株本研究对欧美杨和本氏烟的组培系统进行了优化,并获得了一系列优化培养基的配方,包括:欧美杨外植体愈伤组织诱导培养基:MS+TDZ 0.05 mg/L+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L;本氏烟不定芽分化诱导培养基:MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8.0 g/L;本氏烟生根培养基:MS+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8.0 g/L。完成了寄主诱导的基因沉默体系靶标基因载体的构建,通过农杆菌浸染的叶盘法转染烟草,但由于褐化、污染、愈伤组织及不定芽发生缓慢等问题未筛选到转基因植株,目前还在筛选中。
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