耳聋是临床常见疾病,在耳聋人群中,由内耳毛细胞、听神经及各级听中枢不可逆损伤导致的感音神经性聋占重度耳聋的绝大部分。长期以来,对于感音神经性耳聋的治疗手段有助听器和人工耳蜗植入等,但这些方法并不能从根本上解决问题。人内耳耳蜗中只有约15000个毛细胞,外界声音的过度刺激、化疗、氨基糖苷类药物的副作用及年龄的增长都能够导致有功能的毛细胞数量减少。在人体内,毛细胞的不能再生直接导致听力衰退与耳聋。而毛细胞位于封闭的内耳环境中,加之其数量有限,这成为我们研究其损伤及再生机制的障碍。诱导多能干细胞(iPSCs)技术的兴起为临床研究和治疗耳聋提供了无限可能。这种技术能够对多种体细胞进行重编程,并将其诱导为与胚胎干细胞具有相同全能性的多能性细胞,只要给予一定的分化条件,这种细胞就能在体外诱导分化为几乎所有类型的细胞。这种技术直接规避了利用人胚胎干细胞进行研究的伦理问题；自体iPS细胞的产生也排除了免疫排斥的问题,使个体化医疗成为可能；构建的疾病来源的iPSC成为疾病研究及药物筛选的良好模型。目前已有多种疾病来源的人体细胞被重编程为iPS细胞,但耳聋来源的iPS细胞的建立未见报道。因此,本研究中采用诱导多能干细胞技术,完成了建立MYO7A突变的耳聋病人特异性iPS细胞株、向内耳毛细胞分化及基因矫正的研究。第一部分：首先,我们从正常人、MYO7A基因杂合双突变耳聋患者及其听力表现为正常但MYO7A基因单突变的父亲尿液中提取了尿液细胞,并将其诱导为iPS细胞；其次,我们对构建的三株iPS细胞全能性进行了检测分析。细胞形态、碱性磷酸酶染色、全能性基因表达、全能性标志蛋白免疫荧光、拟胚体形成及分化实验、畸胎瘤形成实验都表明,我们构建的三株iPS细胞均具有全能性。核型分析表明,我们构建的iPS细胞染色体结构正常,并未在诱导过程中受到破坏。最终结果表明,MYO7A突变的耳聋患者来源的尿液细胞与正常细胞一样,都能被重编程为具有全能性的诱导多能干细胞。第二部分：由于MYO7A在内耳耳蜗中只在毛细胞中表达,为了研究这一基因的突变对毛细胞功能有何影响及具体致聋机制,我们将正常人、MY07A突变耳聋患者及其父亲的特异iPS细胞向内耳祖细胞及进一步向内耳毛细胞诱导分化。在诱导过程中,我们采用细胞单层贴壁法,分两个阶段进行。向内耳祖细胞诱导阶段：通过添加FGF3和FGF10,使三株iPS细胞单层贴壁,诱导12天后,iPS细胞诱导分化为内耳神经样祖细胞和内耳上皮样祖细胞。早期内耳标志性基因表达检测和蛋白免疫荧光检测表明,三株iPS细胞成功分化为内耳祖细胞,并且各分化指标在三株细胞间没有显著性差异。这表明,无论是正常的还是MYO7A突变的iPS细胞,都能被诱导分化为内耳祖细胞,三株细胞的分化表现趋向一致。向毛细胞诱导阶段：我们将内耳上皮样祖细胞分离出来,添加EGF和维甲酸,贴壁诱导3周后,对分化的细胞进行毛细胞标志性基因表达检测及毛细胞标志性蛋白免疫荧光检测,结果表明正常人、MYO7A突变耳聋患者及其父亲来源的iPS细胞都能被诱导为毛细胞样细胞,且三株分化的毛细胞样细胞都表现了毛细胞特有的电生理功能。但是,具有MYO7A杂合双突变的分化的毛细胞对于FM1-43具有极低的内吞效率,电生理检测中IK1和ICa与正常iPS细胞来源的毛细胞样细胞相比显著偏大,且其静纤毛在聚拢成束中的表现与正常来源的毛细胞有明显区别；利用western blot对myosin7a蛋白表达检测表明,MY07A突变导致了一个缩短了的myosin7a蛋白的产生。以上结果表明,MY07A的突变是通过影响静纤毛束的功能来使毛细胞功能失常。第三部分：为了研究利用体外细胞株进行基因矫正、以作为临床应用的可行性,我们利用CRISPR-Cas9介导的同源重组技术,对MYO7A杂合双突变来源的iPS细胞的其中一个突变位点进行基因矫正。在经过初步流式分选之后,测序分析和酶切验证分析表明,有7.5%士1.3%的细胞被纯合矫正。之后我们对十个潜在脱靶位点进行PCR测序分析,未见有脱靶现象。全能性检测结果表明,矫正后的iPS细胞株仍具有iPS特异的全能性。这表明我们将杂合双突变中的其中一个突变位点矫正成功。将这一矫正后的细胞株向内耳毛细胞分化后,其在基因表达、蛋白表达等分化指标的表现与正常来源的iPS细胞分化的毛细胞样细胞表现一致,说明经过基因矫正操作后的iPS细胞仍能分化为内耳毛细胞。对这一iPS细胞株分化的毛细胞样细胞进行扫描电镜观察发现,静纤毛重新聚拢成束；Western blot检测表明,myosin7a蛋白条带与正常来源的毛细胞相同；分化的毛细胞中能够内吞FM1-43FX的比例恢复正常水平；电生理检测中,IK1和ICa恢复正常值。以上研究结果表明,我们成功将iPS细胞中MYO7A的一个突变位点进行了基因矫正,并且其分化为毛细胞的功能得到了修复。总之,本研究证明了耳聋来源的尿液细胞能够构建为iPS细胞,同时证明iPS细胞能向内耳毛细胞诱导分化。经过基因矫正的耳聋来源的iPS细胞在向毛细胞分化后,相关功能恢复正常,这为临床治疗耳聋提供了一个新的思路和途径。